Paramètres western blot

[invite8135ca60]

Bonjour à tous.
J'ai une petite demande car je me galère depuis quelques mois à trouver de bonnes conditions pour mes western blot.
Le problème est que je souhaite séparer deux forme de ma protéine, l'une à 200kDa et l'autre à 220kDa...
Le problème est qu'elle ne sont jamais assez séparées donc je ne peux pas voir la différence d'expression en fonction de conditions différentes!

J'ai abandonné les gels 7% pour du 5% (du coup je n'ai plus les affreux smires dû je pense à l'échauffement des prot). J'arrive aussi à avoir un beau transfert et mon anticorps et hyper spécifique).

Le problème est que je n'arrive pas à trouver les bonnes conditions temps & voltage/amperage pour la migration

Donc si quelqu'un avait des conseils ou avez des bonnes conditions pour séparer de grosses prot ce serait génial

Merci d'avance.
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[gorben]

Salut,

Je fais beaucoup de western sur des proteines de 150 et 155Kda. J'utilise un gel 4-12% bis-tris precast (NuPage Novex bis-tris). Je migre dans du tampon MOPS (je te laisse regarder sur le site fournisseur la compo) et ca me donne une super resolution.
Je migre generalement jusqu'a ce que mon bleu sorte du gel (~ 1h) et mes bandes a haut PM sont super bien separee. Je sais que la meme compagnie vend aussi des gels specifiques pour les grosses proteines.

Bonne chance

A+

[invite8135ca60]

J'utilise un gel 4-12% bis-tris precast (NuPage Novex bis-tris).

C'est des gels avec un gradient ou c'est 4% pour le lower et 12% pour le upper gel?
Et tu dis 1heure mais à quels voltage et amperage stp.

Merci

[gorben]

C'est un gradient lineaire de 4 a 12%.
Amp non limitant, voltage ~160-200V. jusqu'a ce que le bleu sorte. Ca donne de tres beau gels.
Mais c'est un systeme special, je pense que tu devrais te renseigner sur le site fournisseur. C'est environ $10 / gel, mais c'est nettement plus pratique, surtout si tu veux faire de la quantification. Les gels sont totalement reproductibles.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

Bonjour,

J'ai déjà fait migrer une protéine de 220 kDa taggée eYFP ce qui élevé sa masse apparente à 250 kDa. Dans les conditions où j'avais la protéine endogène (220 kDa) et la protéine taggée (250 kDa), j'arrivais à séparer les deux formes d'à peine 1/2 cm (suffisant pour pouvoir les distinguer) sur gel 6% en faisant migrer à 80V dans le stacking, 120-130V dans le separating.

L'important n'est pas le voltage pour séparer les deux bandes mais la distance de migration. Le voltage est surtout important pour la résolution des bandes. Je faisais arriver la bande de 60 kDa du marqueur de taille à 1 cm du bas du gel car j'avais une protéine à 60 kDa qui m'intéressait. Mais si tu n'as que ces deux protéines à regarder, n'hésites pas à faire sortir des bandes de l'ordre de 100 kDa, tes deux formes seront d'autant mieux séparées.

Greg