Bonjour à tous,
je viens demander votre avis à propos d'un protocole de génotypage non invasif chez la souris.
Je m'explique :
Jusqu'à présent, je génotype mes souris (knock-out) en faisant une extraction d'ADN rapide à la soude sur un morceau de queue, prélevé sous anesthésie où après sacrifice. Je souhaiterai savoir s'il était possible de génotyper mes petits monstres sans avoir à les opérer.
Vous avez une idée ? muqueuse buccale, poils, fécès... ?
merci à vous !
Normalement on y arrive à partir des crottes. Les souris vous en offre régulièrement quand vous les attrapez. Cependant, je ne pense pas que ce soit quand même très pratique sur les très jeunes souris.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Ce n'est pas un problème, je les génotype assez tard générallement.
Penses-tu qu'un protocole comme celui-ci pourrait marcher :
- Incubation 30min à 100°C d'une crotte avec 400µl de NaOH 50mM
- Vortex, neutralisation du pH (TrisHCl) et centrifugation 5 min à 4°C Vmax
- Récupération du surnageant pour faire la PCR directement (pas de précipitation)
C'est sur la base de mon protocole actuel. Peut-être faut il plusieurs crottes ?
Merci !
Attention à l'odeur, car bouillir une crotte pendant 30 minutes, ça risque d'être très déplaisant! Je dis ça pour vous, mais surtout pour vos collègues qui n'ont rien demandé...Manip sous hotte à évacuation extérieure de préférence.
Greg
C'est sûr que je vais en faire rigoler plus d'un au labo à faire bouillir des crottes de souris...
Entre-temps j'ai trouvé deux papiers intéressants :
- le premier montre qu'il est possible de génotyper une souris à partir d'une crotte, cela-dit le protocole d'extraction est long et compliqué (2 jours, beaucoup d'étapes)
- le deuxième consiste simplement à faire bouillir une "touffe" de poils (aucune info sur la quantité que cela représente) 5 min dans le NaOH 50mM. On peut ensuite faire la PCR directement sur le surnageant après neutralisation.
J'essaie ça demain si je trouve le temps. Si ça intéresse quelqu'un je vous en donnerai des nouvelles...
Pour ceux que ça intéresse,
le génotypage sur les poils marche vraiment bien.
J'ai pris une dizaine de poils à deux souris ce matin (ça n'a pas l'air de les avoir dérangé plus que ça au passage) et dans la foulé j'ai fait une extraction au NaOH toute bête.
J'ai juste augmenté le nombre de cycles pour la PCR par rapport aux échantillons obtenus sur la queue.
Tout a très bien fonctionné sur mes deux échantillons.
Sur les fécès je n'ai rien eu, mais je m'y attendais car je n'ai pas fait de précipitation (or il y a pas mal d'inhibiteurs de PCR dans les fécès). En passant par une étape phénol/chloroforme et une précipitation ça devrait aller mais étant donné que le premier protocole est cent fois plus simple je ne vais pas m'amuser à l'essayer.
