Génotypage--pcr

[invite16813ba1]

bjr à ts
nouvelle sur ce forum je vs écrit afin de vs demander de l'aide.actuellement en stage mon travail est centré sur l'adaptation du génotypage sur une nouvelle machine le LC 480.il s'agit donc de PCR en temps réél.
jai choisi et commandé mes deux amorces .mon principal probleme est que je n'arrive pas à faire en sorte que mes genotypes soient différenciés.je mexplique: je dois differencier les genotypes sensibles des resistants et il se trouve que l'analyse est sensible de part la normalisation et mes genotypes sont mal classés et donc c'est insatisfaisant pour mes résultats
jai changé la concentration en amorces fait varié dautres paramètres mais en vain...je pense certaineme,t que le probleme se situe dans le réglage de la normalisation à peine je change mes valeurs,mes résultats sont complètement différent.malheureusement dans mon labo aucune personne n'a les compétences pour régler la normalisation et moi encore moins....je découvre à peine la PCR..
PLEASE UNE REPONSE...
ds l'attente...
cordialement

merci de faire un peu attention a ton ecriture. Tu n'es pas sur MSN, donc prend le temps d'écrire correctement. YOyo
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[invite16813ba1]

jai oublié de preciser que jutilise gene scanning et kit HRM

[invite6055d2a6]

Bonjour
as-tu remarqué que tu as posté dans la section "humour"? Il faudrait que quelqu'un déplace ton message dans une section plus appropriée...

[invite16813ba1]

oui merci dsl

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite16813ba1]

bonjour à tous
nouvelle sur ce forum je vous écrit afin de vous demander de l'aide.actuellement en stage mon travail est centré sur l'adaptation du génotypage sur une nouvelle machine le LC 480.il s'agit donc de PCR en temps réel.
jai choisi et commandé mes deux amorces .mon principal probleme est que je n'arrive pas à faire en sorte que mes genotypes soient différenciés.je mexplique: je dois differencier les genotypes sensibles des resistants et il se trouve que l'analyse est sensible de part la normalisation et mes genotypes sont mal classés et donc c'est insatisfaisant pour mes résultats
jai changé la concentration en amorces et fait varié dautres paramètres mais en vain...je pense certainement que le probleme se situe dans le réglage de la normalisation à peine je change mes valeurs,mes résultats sont complètement différents.malheureusement dans mon labo aucune personne n'a les compétences pour régler la normalisation et moi encore moins....je découvre à peine la PCR..
PLEASE UNE REPONSE...
dans l'attente...
cordialement

merci de faire un peu attention a ton ecriture. Tu n'es pas sur MSN, donc prend le temps d'écrire correctement. YOyo

désolé si je ne suis pas très claire par ma facon d'écrire mais le temps je ne l'ai plus trop.

[piwi]

Oui mais si tu n'es pas claire nous on ne comprend rien. Du coup, comme nous aussi n'avons pas trop de temps et bien tu passes à la trappe.

C'est quoi un génotype sensible?

Cordialement,
piwi

[invite16813ba1]

Il existe au sein des populations d’ovins différentes formes de PrP non pathologiques. En fonction de la structure de leur gène PrP, on s’est aperçu que les moutons ne développaient pas de la même manière la maladie. Ce qui distingue ces différentes formes de PrP entre elles, c’est la nature de trois acides aminés que l’on trouve aux positions 136,145 et 171 et que l’on désigne sous leurs initiales : alanine(A), arginine(R), glutamine (Q) et valine(V).
4 allèles du gène codant pour la PrP sont connus :

VRQ
C’est la forme hyper-sensible à la tremblante. Lorsqu’ils sont contaminés par le prion, les moutons qui sont homozygotes VRQ/VRQ développent rapidement la maladie. On retrouve des traces détectables de prion dans de nombreux organes de l’animal tout au long de l’incubation de la maladie.

ARQ
Il s’agit du gène originel. Les animaux porteurs de ce gène sont relativement sensibles à la maladie.

AHQ
Comme précédemment, le gène AHQ détermine une sensibilité intermédiaire à la tremblante. Il est relativement rare.

ARR
C’est le gène de résistance quasi-absolue à la tremblante. De plus les animaux porteurs d’au moins un allèle ARR sont semi-résistants à la maladie. Dans ce cas, la multiplication du prion est très lente, elle se limite au système nerveux et le prion n’est pas détectable avant l’apparition de signes cliniques.




Adaptation de l’analyse au Light Cycler 480



Utilisation pour l’amplification
du kit HRM comprenant :
-Mgcl2
-Eau
-master mix
de deux nouvelles amorces


1er objectif

Cryptage des génotypes résistants ARR/ARR

[invite5d3aeb49]

Bonjour,

A mon avis si tu n'arrives pas a designer d'amorces assez sensibles pour distinguer une seule mutation ponctuelle par pcr, tu peux toujours essayer par TILLING.

[Zellus]

Salut,

Comment fais-tu ta normalisation ? Quels gènes utilises-tu ?

[invite16813ba1]

je dois faire un criblage de genotypes résistants.j'utilise le gène Prp d'une chaine de 253 acides aminés.j'ai tenté de diluer l'échantillon et d'ajouter de la taq polymérase mais le groupe arr/arr n'est pas formé.l'appareil n'arrive pas à grouper les memes génotypes ensembles.jai fait varié la concentration en amorces , en Mgcl2 pour améliorer l'amplification .j'ai trouvé des concentrations optimales mais toujours en vain un criblage des ARR/ARR impossible.pourtant impossible n'est pas français....