Répondre à la discussion
Affichage des résultats 1 à 14 sur 14

La PCR et ses petis bugs



  1. #1
    loli62

    La PCR et ses petis bugs

    Bonjour, je me présente Loli62, 21 ans étudiantes en Licences Bio et actuellement en stage dans un laboratoire de biologie moléculaire.
    Cela fait 3 mois que j'essaie de résoudre des problèmes de PCR, et là je ne sais vraiment plus quoi faire.
    Parfois elle marche, des fois non.
    Quand cela ne marche pas, j'ai des smires et des taches claires au fond du gel (même dans le mix). Mais la migration se fait bien car les marqueur de taille migrent sans problèmes.
    On a pensé à un problème d'amorces, donc j'ai fait des gradient de températures. La multiplex marchait à 60°c mais la elle ne marchent plus.
    J'ai donc testé des gradient de concentrations en amorces, et aucun résultats.
    On pense donc à une DNAse, ou à une réaction parasites entre amorces. Cependant ces réaction marchait parfaitement il y a de ça 6 mois.......
    Donc si quelqu'un a une idée de ce que je peux faire, merci de me répondre au plus vite.
    PS: je joins une photo pour que vous ayez un aperçut de mes résultats.
    Merci d'avance

    -----

    Images attachées Images attachées

  2. Publicité
  3. #2
    Pfhoryan

    Re : La PCR et ses petis bugs

    Citation Envoyé par loli62 Voir le message
    On a pensé à un problème d'amorces, donc j'ai fait des gradient de températures. La multiplex marchait à 60°c mais la elle ne marchent plus.
    Probablement les amorces qui doivent être pourries. Il faut en acheter des nouvelles fraîches.

    --
    Pfhoryan
    "Toute vérité franchit trois étapes. D’abord elle est ridiculisée. Ensuite, elle subit une forte opposition. Puis, elle est considérée comme ayant toujours été une évidence." - Arthur Schopenhauer

  4. #3
    loli62

    Re : La PCR et ses petis bugs

    Merci de ta réponse.
    Le truc c'est que c'est le troisième lots d'amorces que je teste... Un lot très vieux qui marchait avant, un lot qui n'a jamais marché et un nouveau lot.

  5. #4
    Pfhoryan

    Re : La PCR et ses petis bugs

    Citation Envoyé par loli62 Voir le message
    Merci de ta réponse.
    Le truc c'est que c'est le troisième lots d'amorces que je teste... Un lot très vieux qui marchait avant, un lot qui n'a jamais marché et un nouveau lot.
    Alors il faut tout tester: polymérase, matrice...
    J'ai remarqué qu'il y avait parfois beaucoup de matériel restant dans tes puits. Ce n'est pas bon signe. Par contre, les tâches claires que tu vois en bout de gel, ce sont tes amorces.

    --
    Pfhoryan
    "Toute vérité franchit trois étapes. D’abord elle est ridiculisée. Ensuite, elle subit une forte opposition. Puis, elle est considérée comme ayant toujours été une évidence." - Arthur Schopenhauer

  6. #5
    menobo

    Re : La PCR et ses petis bugs

    En ce qui me concerne, je penche pour renouveler les amorces. Ensuite il faut vérifier la calibration du thermocycler. faire les différents tests de températures inclus dans la machine, attention au "Ramping" j'ai eu une fois ce genre de problème, et il a fallu tout simplement jouer sur la vitesse d'incrémentation thermique.
    L'inventeur de l'eau en poudre...

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    julilou

    Re : La PCR et ses petis bugs

    Si tu as changé les produits de pcr il se peut que cela vienne de ton ADN... L'extraction est peut être foireuse. Si tu travaille sur le mémé adn depuis le début il s'est peut etre dégradé (reste de dnase, congélation décongélation...)

  9. Publicité
  10. #7
    loli62

    Re : La PCR et ses petis bugs

    J'ai déjà changer mon ADN et vérifiè les concentration en ADN grâce à un biophotomètre.
    Pour la congélation/décongelation, on a effectivement eu un problème de congélateur, mais on a changer et le nouveau lot d'amorce et d'enzyme a été mis dans le nouveau congel, de plus on fait des aliquots pour eviter de sortir trop de fois les tubes.
    Pour la DNAse comment s'en rendre compte ?? et surtout comment s'en débarrasser ???

  11. #8
    loli62

    Re : La PCR et ses petis bugs

    Le thermo a été vérifié il y a 1 mois chez biorad, et il n'avait rien.
    Comment modifier la vitesse d'incrémentation de la température, a-t-on avis dois-je l'augmenter ou la diminuer ???

    Merci a tous de vos réponses.

  12. #9
    John Irwin

    Re : La PCR et ses petis bugs

    Sa m'aurait étonné que ce soit le thermocycleur, sa tient bien la route et puis c'est contrôler. Tu as quand même beaucoup d'amorces en bas de gel, tu pourrais vérifier que la concentration de ton stock d'amorces est correcte.

    Pour vérifier si tu as pas de DNase, tu met de l'ADN, ta matrice par exemple avec chacun des réactifs séparement, tu incube 1h à 37°C, puis tu dépose sur un gel d'agarose BET normal. Si tu vois un smear ou plus rien quelques part, c'est qu'une DNase est passé par là ...

  13. #10
    menobo

    Re : La PCR et ses petis bugs

    Autre possibilité: les inhibiteurs
    quelque fois le sang prélevé sur héparine en est la cause
    il peut également y en avoir dans les réactifs d'extraction (eau, etc) et bien entendu on en arrive à des amplifications incertaines qui marchent une fois sur dix.
    il ne serrait pas inintéressant de tester un échantillon prélevé bien avant et qui a marché.
    L'inventeur de l'eau en poudre...

  14. #11
    menobo

    Re : La PCR et ses petis bugs

    pour ce qui est de la température il vaut mieux diminuer la vitesse d'incrémentation même si ça veut dire une heure de plus dans le temps global de ta réaction. (la plupart des cyclers sont réglés à prendre 3°/s, certains font même 6°/s (j'ai eu un souci avec une tellemachine de chez eppendorf, n'hésite pas s'ilel faut après tout ça à descendre à 1.5°/s (RAMP à 50%)
    L'inventeur de l'eau en poudre...

  15. #12
    loli62

    Red face Re : La PCR et ses petis bugs

    Citation Envoyé par menobo Voir le message
    pour ce qui est de la température il vaut mieux diminuer la vitesse d'incrémentation même si ça veut dire une heure de plus dans le temps global de ta réaction. (la plupart des cyclers sont réglés à prendre 3°/s, certains font même 6°/s (j'ai eu un souci avec une tellemachine de chez eppendorf, n'hésite pas s'ilel faut après tout ça à descendre à 1.5°/s (RAMP à 50%)
    Merci, j'ai vérifier mon thermo il est à 0.1°/s est-ce trop peu ?? dois-je l'augmenter ??
    Je vais appeler Biorad cet aprem.
    Sinon pour tester un vieux prélèvement ce n'est pas possible, car on part de souches de bactéries prélevées dans l'environnement industriel. Donc les souches sont congelées en tube et on remet sur boite quand on veut faire un extrait. On fait que 100µL d'extrait et donc il est utilisé assez vite.

  16. Publicité
  17. #13
    loli62

    Re : La PCR et ses petis bugs

    Citation Envoyé par John Irwin Voir le message
    Sa m'aurait étonné que ce soit le thermocycleur, sa tient bien la route et puis c'est contrôler. Tu as quand même beaucoup d'amorces en bas de gel, tu pourrais vérifier que la concentration de ton stock d'amorces est correcte.

    Pour vérifier si tu as pas de DNase, tu met de l'ADN, ta matrice par exemple avec chacun des réactifs séparement, tu incube 1h à 37°C, puis tu dépose sur un gel d'agarose BET normal. Si tu vois un smear ou plus rien quelques part, c'est qu'une DNase est passé par là ...
    Bonjour, j'ai fait le test que tu m'avais proposé pour la DNAse je met la photo après migration sur agarose BET peut-tu m'aider pour l'interprétation ?
    Le 1 er puits contient mon ADN pur (extrait) puis les autres contiennent l'ADN plus (un réactif par puits) l'eau, le tampon, les DNTP, amorce1, amorce 2, amorce 3, amorce 4, amorce 5, amorce 6, le MgCl2, et la taq.
    merci d'avance
    Si vous avez des hypothèse pour régler mes problème je suis preneuse
    Images attachées Images attachées

  18. #14
    stonekiller

    Re : La PCR et ses petis bugs

    Je ne sais pas si tes amorces sont parfaites mais, si elle sont dégénéré cela peu tout simplement venir du fabriquant. En effet quand tu commandes des amorces dégénéré les proportions d'une base sur un autre varie grandement (tu peux commander deux fois la meme amorces, tu n'aura pas exactement la meme soltuion). J'avais deja recommander des amorces qui ne marchait pas non plus, la commande suivante à été la bonne .

    Bon courage

Sur le même thème :

Discussions similaires

  1. [Biologie Moléculaire] PCR en temps réel ou Q-PCR
    Par belouga7 dans le forum Biologie
    Réponses: 4
    Dernier message: 22/10/2008, 18h09
  2. Les bugs de la technologies
    Par DomiM dans le forum Technologies
    Réponses: 0
    Dernier message: 30/07/2006, 12h27
  3. bugs video ?
    Par kikiboo dans le forum Matériel - Hardware
    Réponses: 8
    Dernier message: 16/04/2006, 10h35