La PCR et ses petis bugs

[invite0ced4063]

Bonjour, je me présente Loli62, 21 ans étudiantes en Licences Bio et actuellement en stage dans un laboratoire de biologie moléculaire.
Cela fait 3 mois que j'essaie de résoudre des problèmes de PCR, et là je ne sais vraiment plus quoi faire.
Parfois elle marche, des fois non.
Quand cela ne marche pas, j'ai des smires et des taches claires au fond du gel (même dans le mix). Mais la migration se fait bien car les marqueur de taille migrent sans problèmes.
On a pensé à un problème d'amorces, donc j'ai fait des gradient de températures. La multiplex marchait à 60°c mais la elle ne marchent plus.
J'ai donc testé des gradient de concentrations en amorces, et aucun résultats.
On pense donc à une DNAse, ou à une réaction parasites entre amorces. Cependant ces réaction marchait parfaitement il y a de ça 6 mois.......
Donc si quelqu'un a une idée de ce que je peux faire, merci de me répondre au plus vite.
PS: je joins une photo pour que vous ayez un aperçut de mes résultats.
Merci d'avance
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[Pfhoryan]

On a pensé à un problème d'amorces, donc j'ai fait des gradient de températures. La multiplex marchait à 60°c mais la elle ne marchent plus.

Probablement les amorces qui doivent être pourries. Il faut en acheter des nouvelles fraîches.

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Pfhoryan
"Toute vérité franchit trois étapes. D’abord elle est ridiculisée. Ensuite, elle subit une forte opposition. Puis, elle est considérée comme ayant toujours été une évidence." - Arthur Schopenhauer

[invite0ced4063]

Merci de ta réponse.
Le truc c'est que c'est le troisième lots d'amorces que je teste... Un lot très vieux qui marchait avant, un lot qui n'a jamais marché et un nouveau lot.

[Pfhoryan]

Merci de ta réponse.
Le truc c'est que c'est le troisième lots d'amorces que je teste... Un lot très vieux qui marchait avant, un lot qui n'a jamais marché et un nouveau lot.

Alors il faut tout tester: polymérase, matrice...
J'ai remarqué qu'il y avait parfois beaucoup de matériel restant dans tes puits. Ce n'est pas bon signe. Par contre, les tâches claires que tu vois en bout de gel, ce sont tes amorces.

--
Pfhoryan
"Toute vérité franchit trois étapes. D’abord elle est ridiculisée. Ensuite, elle subit une forte opposition. Puis, elle est considérée comme ayant toujours été une évidence." - Arthur Schopenhauer

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitecfcf6281]

En ce qui me concerne, je penche pour renouveler les amorces. Ensuite il faut vérifier la calibration du thermocycler. faire les différents tests de températures inclus dans la machine, attention au "Ramping" j'ai eu une fois ce genre de problème, et il a fallu tout simplement jouer sur la vitesse d'incrémentation thermique.

[invitef08e6467]

Si tu as changé les produits de pcr il se peut que cela vienne de ton ADN... L'extraction est peut être foireuse. Si tu travaille sur le mémé adn depuis le début il s'est peut etre dégradé (reste de dnase, congélation décongélation...)

[invite0ced4063]

J'ai déjà changer mon ADN et vérifiè les concentration en ADN grâce à un biophotomètre.
Pour la congélation/décongelation, on a effectivement eu un problème de congélateur, mais on a changer et le nouveau lot d'amorce et d'enzyme a été mis dans le nouveau congel, de plus on fait des aliquots pour eviter de sortir trop de fois les tubes.
Pour la DNAse comment s'en rendre compte ?? et surtout comment s'en débarrasser ???

[invite0ced4063]

Le thermo a été vérifié il y a 1 mois chez biorad, et il n'avait rien.
Comment modifier la vitesse d'incrémentation de la température, a-t-on avis dois-je l'augmenter ou la diminuer ???

Merci a tous de vos réponses.

[invite9e1fd470]

Sa m'aurait étonné que ce soit le thermocycleur, sa tient bien la route et puis c'est contrôler. Tu as quand même beaucoup d'amorces en bas de gel, tu pourrais vérifier que la concentration de ton stock d'amorces est correcte.

Pour vérifier si tu as pas de DNase, tu met de l'ADN, ta matrice par exemple avec chacun des réactifs séparement, tu incube 1h à 37°C, puis tu dépose sur un gel d'agarose BET normal. Si tu vois un smear ou plus rien quelques part, c'est qu'une DNase est passé par là ...

[invitecfcf6281]

Autre possibilité: les inhibiteurs
quelque fois le sang prélevé sur héparine en est la cause
il peut également y en avoir dans les réactifs d'extraction (eau, etc) et bien entendu on en arrive à des amplifications incertaines qui marchent une fois sur dix.
il ne serrait pas inintéressant de tester un échantillon prélevé bien avant et qui a marché.

[invitecfcf6281]

pour ce qui est de la température il vaut mieux diminuer la vitesse d'incrémentation même si ça veut dire une heure de plus dans le temps global de ta réaction. (la plupart des cyclers sont réglés à prendre 3°/s, certains font même 6°/s (j'ai eu un souci avec une tellemachine de chez eppendorf, n'hésite pas s'ilel faut après tout ça à descendre à 1.5°/s (RAMP à 50%)

[invite0ced4063]

pour ce qui est de la température il vaut mieux diminuer la vitesse d'incrémentation même si ça veut dire une heure de plus dans le temps global de ta réaction. (la plupart des cyclers sont réglés à prendre 3°/s, certains font même 6°/s (j'ai eu un souci avec une tellemachine de chez eppendorf, n'hésite pas s'ilel faut après tout ça à descendre à 1.5°/s (RAMP à 50%)

Merci, j'ai vérifier mon thermo il est à 0.1°/s est-ce trop peu ?? dois-je l'augmenter ??
Je vais appeler Biorad cet aprem.
Sinon pour tester un vieux prélèvement ce n'est pas possible, car on part de souches de bactéries prélevées dans l'environnement industriel. Donc les souches sont congelées en tube et on remet sur boite quand on veut faire un extrait. On fait que 100µL d'extrait et donc il est utilisé assez vite.

[invite0ced4063]

Sa m'aurait étonné que ce soit le thermocycleur, sa tient bien la route et puis c'est contrôler. Tu as quand même beaucoup d'amorces en bas de gel, tu pourrais vérifier que la concentration de ton stock d'amorces est correcte.

Pour vérifier si tu as pas de DNase, tu met de l'ADN, ta matrice par exemple avec chacun des réactifs séparement, tu incube 1h à 37°C, puis tu dépose sur un gel d'agarose BET normal. Si tu vois un smear ou plus rien quelques part, c'est qu'une DNase est passé par là ...

Bonjour, j'ai fait le test que tu m'avais proposé pour la DNAse je met la photo après migration sur agarose BET peut-tu m'aider pour l'interprétation ?
Le 1 er puits contient mon ADN pur (extrait) puis les autres contiennent l'ADN plus (un réactif par puits) l'eau, le tampon, les DNTP, amorce1, amorce 2, amorce 3, amorce 4, amorce 5, amorce 6, le MgCl2, et la taq.
merci d'avance
Si vous avez des hypothèse pour régler mes problème je suis preneuse

[invite899b80e1]

Je ne sais pas si tes amorces sont parfaites mais, si elle sont dégénéré cela peu tout simplement venir du fabriquant. En effet quand tu commandes des amorces dégénéré les proportions d'une base sur un autre varie grandement (tu peux commander deux fois la meme amorces, tu n'aura pas exactement la meme soltuion). J'avais deja recommander des amorces qui ne marchait pas non plus, la commande suivante à été la bonne .

Bon courage