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Principe de la LM-PCR



  1. #1
    tortuga

    Principe de la LM-PCR


    ------

    Bonjour,

    Quelqu'un pourrait-il m'expliquer simplement ce qu'est la LM-PCR (Ligation-Mediated PCR) et ses différences avec la PCR classique?

    J'ai bien une petite idée, mais le peu de sites/reviews/articles que j'ai trouvé me laissent perplexe et dans le flou, aussi j'ai besoin de savoir simplement l'essentiel

    Merci à tous et bonne journée!

    -----
    Dernière modification par tortuga ; 21/04/2005 à 04h39.

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  3. #2
    tortuga

    Re : Principe de la LM-PCR

    Autre question qui découle: pourquoi la préfere-t-on (si j'ai bien compris) lorsqu'on fait un ChIP2 (ChIP sur puce à ADN)?

  4. #3
    91benny91

    Re : Principe de la LM-PCR

    La LM-PCR est utilisé pour la technique de ChIP on Chip qui a été developpé afin de rechercher les sequences nucléotidiques associées a une protéines d'interet (Facteur de transcription) sur tout le génome. Elle permet d'amplifier les sequences d'ADN intergéniques coimmunoprécipité lors de la ChIP de séquence inconnue. Ces derniers sont tout d'abord rendu bout franc grace a la T4 DNA polymérase (ote les extensions en 3' et remplit les extension en 5').. Puis on y lie deux linker A et B complémentaire (B étant plus court que A il a un Tm beaucoupl plus faible).

    1er étape : Ligation des adaptateurs à l'ADN
    - A se lie en 5' de chaque brin de la molécule d'ADN
    - B est lié par complémentarité a A mais ne peut etre lier au 3' de chaque simple brin de la molécule d'ADN ne possédant pas de phosphate5'

    2éme étape:Elongation sans dénaturation
    -2min à 55°C pour enlevé l'adaptateur B (Tm beaucoup plus faible) qui n'a servi que à la ligation
    - élongation normal : 5min à 72C

    ==> t'obtient une molécule d'ADN double brin avec a chaque extrémité l sequence de l'adaptateur A

    3eme étape : PCR normal avec un nucléotide marqué avec un fuorophore donnée, A servant pour concevoir les amorces.

    Tu fait la meme chose avec un autre fluorophore pour l'ADN total non coimmunoprécipté lors de la ChIP et t'hybride le tout sur une puce possédant une banques de séquences intergénique et le tour est jouer.

    FAIT UN SCHEMA ca sera plus simple

  5. #4
    gorben

    Re : Principe de la LM-PCR

    Salut,

    En complement de ce qui a ete decrit ci-dessus, voila un lien ou c'est bien explique. Il y a egalement ce lien la

    Globalement, ca permet de faire une PCR quand tu ne connais pas ta sequence, puisque tu as fixe un adaptateur lors de la premiere etape. Les applications sont donc multiples :
    * In vivo footprint
    * ChIP-chip
    * PCR sur fragment inconnu
    * WGA

    C'est une technique bien utile quand la quantitee d'ADN a etudier n'est pas suffisante. En revanche, ca reste une technique de PCR precedee d'une ligation, donc ce n'est en rien quantitatif...

    A+

  6. A voir en vidéo sur Futura
  7. #5
    S@m

    Re : Principe de la LM-PCR

    Bonjour

    En effet la LM-PCR n'est pas utilisée que pour le CHIP, c'est une méthode "générale" pour isoler et amplifier des séquences dont on n'a pas de primers spécifiques.
    Elle sert aussi pour isoler les sites d'intégration de virus par exemple.
    Il existe une variante, l'Inverse-PCR, qui est un peu moins sensible (une étape de PCR en moins par rapport à la LM-PCR que je faisais). Par contre elle peut être semi-quantitative (selon les conditions et la source d'ADN)

  8. #6
    Berk

    Re : Principe de la LM-PCR

    Bonjour,
    il y a un truc que je ne comprend pas avec la LM-PCR,
    pour l'amplification, il y a bien l'utilisation de sondes spécifiques autres que celles pour le linker ?(je fais référence au schéma du lien),
    donc comment fait on si on ne connait pas du tout la séquence
    du fragment ADN à amplifier?

    je ne sais pas si je suis tres claire mais si vous pouvez m'aider
    merci d'avance

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