Etude de la phosphorylation d'une protéine

[invite10adf645]

Bonjour à tous,

je travail sur une protéine membranaire pour laquelle il n'existe pas d'anticorps dirigés contre la forme phosphorylée. De plus il existe de nombreux sites de phosphorylation théoriques (mais rien de très clair là dessus).
Je souhaiterai étudier l'état de phosphorylation de cette protéine mais les kits que j'ai vu sont hors de prix (340€ pour 6 colonnes chez Qi...) !!
Donc si vous aviez des conseils à me donner (je précise que je travail sur du tissu animal et en très faible quantité) cela m'aiderai beaucoup dans ma démarche.
Vu que j'ai l'anticorps contre ma protéine, je pensait faire une immunoprécipitation pour ensuite réaliser un blot anti ser/thr/tyr phorsphorylées. Ou l'inverse (IP anti ser/thr/tyr suivi d'un WBlot contre ma protéine) ?
Peut-être existe-t-il d'autres methodes (sur colonne par exemple) pas trop onéreuses ?

Merci d'avance de votre aide !
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[Zellus]

Salut,

Tu pourrais peut-être faire une électrophorèse bidimensionnelle pour mieux visualiser les différents états de phosphorylation de ta protéine non ?
C'est juste une idée comma ça.

[invite10adf645]

Ben c'est à ça que j'ai pensé en premier mais un collègue qui en fait pas mal m'a dit que ça ne serait pas évident de réussir à séparer clairement la protéine phosphorylée sur un gel 2D. Je ne sait pas si ça change qqch mais c'est une grosse protéine (210kDa).
En plus peut-on être sûr que le décalage ne vient pas d'une glycosylation par exemple ?

[Zellus]

En fait je pensais aussi faire un western sur ton gel avec des anticorps anti-Ser/Thr/Tyr phorsphorylées et anti-"ta-protéine". Je n'ai jamais fait de 2D mais je sais que ça se fait. Et puis pour les grosses protéines ont peut aussi faire des gels d'agarose, au moins pour la première dimension.

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteedc22d93]

Bonjour,
ta question correspond plus ou moins au travail que je suis en train de réaliser. Je dois déterminer l'état de phosphorylation d'une protéine virale que je surexprime de façon transitoire dans des cellules humaines. Premier problème, cette protéine s'exprime faiblement donc je ne dispose que de peu de matériel (comme toi apparement).
Heureusement cette protéine est couplée à l'EGFP, j'ai donc pu mettre au point une immunoprécipitation pour la séparer des autres protéines cellulaire sur SDS-PAGE. En parallèle je réalise un blot avec l'anticorps dirigé contre la protéine virale. Ensuite je découpe sur mon gel coloré au nitrate d'argent la bande immunoprécipitée correspondant à ma protéine. J'avais tellement peu de protéine que je ne voyait pas la bande colorée, j'ai donc découpée à l'aide du blot et des marqueurs! Puis j'ai envoyé cette bande découpée à analyser par spectrométrie de masse, peut-être disposes-tu d'une plateforme qui pourrait réaliser ça pour toi. Ce n'est pas si onéreux, en tout cas moins que tes colonnes. S'ils possèdent un spectromètre adapté ils pourront identifier n'importe quelle modification post-traductionnelle! En tout cas je ne te conseil pas les anticorps anti sérine ou tyrosine phosphorylés. D'après mon expérience, ceux-ci sont peu fiable. Surtout que si ta protéine n'est pas purifiée, tu as pas mal de chance d'allumer une protéine contaminante!
J'espère que j'ai pu t'aider ou te donner des idées. Bon courage

[invite10adf645]

Merci pour ces infos (et désolé de répondre aussi tard) !

Aeris, on a bien une plateforme de spectro de masse. Tu penses qu'ils peuvent quantifier le niveau de phosphorylation si je leur envoie ma protéine précipitée après divers traitements ?
Je ne connais pas bien la technique, mais je crois qu'on digère la protéine en peptides qui ont des temps de vol plus ou moins longs, et caractéristiques de cette même protéine.
Du coup un peptide phosphorylé verrait sa masse (et du coup son temps de vol) modifiée, c'est bien ça ?

C'est vrai que ce serait une solution intéressante, surtout s'il y a moyen de séquencer les peptides phosphorylés pour chercher les résidus impliqués (et pourquoi pas me lancer dans de la mutagénèse dirigée).

[inviteedc22d93]

En effet je pense que la spectro de masse peut être une bonne solution. Ils peuvent identifier le résidu modifié et le pourcentage de résidus modifiés!
Ensuite la mutagénèse te permettrait de voir le rôle de cette modification.

[Flyingbike]

et pourquoi pas IP ta protéine et faire un western avec un anticorps anti phosphosérine, phosphotyrosine, etc ?

[invite10adf645]

Je me renseigne pour la spectro...

Flyingbike c'est aussi à l'IP que j'ai pensé en premier. J'ai chopé un anticorps anti pSer/pTyr/pThr (un monoclonal sensé reconnaitre les 3 résidus phosphorylés) pas mal documenté dans la biblio.
Du coup je pense précipiter ma protéine et faire un blot avec cet anticorps par la suite.

Seul problème : pour l'IP il faut apparemment des quantités énormes de protéines, ce qui va être difficile vu la taille des ganglions qui m'intéressent... Je vais avoir besoin du facteur chance pour que la mise au point ne soit pas trop difficile !