mise en évidence d'une phosphorylation

[invitea175c768]

bonjour,
je travaille sur une protéine dont je voudrais mettre en évidence l'état phosphorylé. J'ai un faible marquage de cette protéine par un anticorps anti-phosphosérine/thréonine mais je voudrais m'assurer qu'il sagit bien d'un marquage spécifique. Pour celà, je regarde si ce signal disparait après traitement phosphatase (CIP ou lambda). Pour optimiser la réaction, j'aimerais pouvoir inactiver les inhibiteurs de phophatase (NaF et orthovanadate) présents dans le lysat cellulaire. Quelqu'un connait il une technique non dénaturante permettant d'inactiver ces inhibiteurs avant le test phosphatase ?
merci de vos réponses.
Tant que j'y suis, avez vous des suggestions à me faire concernant les approches utilisables pour mettre en évidence l'état phosphorylé SANS avoir recourt au marquage métabolique au 32P, impossible dans mon labo

merci à tous de votre aide.
Vav
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[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura ,

Pour l'inactivation des inhibiteurs de phosphatase, je ne sais pas et je ne pense pas qu'ils puissent être inactivables facilement : ce sont des molécules simples, stables. Le mieux je pense est de refaire un lysat cellulaire sans inhibiteur de phosphatase.

Pour la mise en évidence d'une phosphorylation, dans le cas où le résultat va être publié, il vous faudra forcément un marquage métabolique, je ne pense pas qu'une revue accepte qu'il manque une expérience aussi démonstrative... Si vous avez une idée de la kinase phosphorylant votre protéine, vous pouvez définir le(s) site(s) phosphorylés sur la protéine grâce à des logiciels bioinformatiques et à la séquence consensus de phosphorylation de la kinase (si cette séquence a déjà été définie). D'autres étapes vont dépendre de la connaissance de la kinase et de ces sites de phosphorylation, pour continuer à vous aider, il faut donc que je sache si vous détenez ces informations.

A plus tard,

Greg

[invitea175c768]

merci greg de vos conseils
en fait , nous n'avons pas l'habilitation pour manipuler le 32P dans le labo. Je dois donc faire un maximum de manips en froid avant de faire une manip décisive en chaud. C'est pour celà que je tente pour l'instant de mettre en évidence la phosphorylation par western. La kinase qui me semble etre la meilleure candidate pour ma protéine est la PKA. Le site de phosphorylation est situé en Cter de la protéine sur une séquence qui ressemble à un consensus PKA (IKLLTGKRV) mais qui pourrait également être cible de la PKC
Voilà toutes les infos que je peux vous fournir.
Mercie ncore
valérie

[invite71f23525]

D'accord.

Déjà, afin d'être sûre que la PKA ou la PKC phosphoryle la protéine in cellulo, vous pouvez transfecter des siRNA spécifiques de la PKA ou de la PKC et regarder si le marquage phosphosérine/phosphothréonine diminue voire n'apparait plus en western blot. La manip inverse peut aussi être une validation supplémentaire c'est à dire transfecter un plasmide surexprimant la PKA ou la PKC et regarder en western blot si le marquage par l'anticorps anti-phosphosérine/thréonine augmente.

Ensuite, si l'une des kinases (ou les deux) phosphoryle votre protéine, cela veut dire qu'elle interagissent physiquement entre elles. Dans ce cas, cela peut être mis en évidence par co-immunoprécipitation : immunoprécipitation anti-kinase, western blot anti-protéine d'intérêt ; immunoprécipitation anti-protéine d'intérêt, western blot anti-kinase. Pour approfondir la spécificité de phosphorylation de votre protéine, vous pouvez faire de la mutagenèse dirigée sur la séquence consensus (par sur la sérine ou thréonine potentiellement phosphorylée par contre), qui devrait empêcher sa reconnaissance par la kinase. Après mutagenèse, vous transfectez la construction mutante dans les cellules, elle agira comme dominant négatif de cette phosphorylation sur la protéine endogène et normalement en western blot anti-phosphosérine/thréonine vous aurez une diminution ou abolition du signal.

Enfin, si vous suspectez un rôle cellulaire liée à cette phosphorylation, vous pouvez muter la sérine ou thréonine en arginine. Cette mutation est phosphomimétique c'est à dire qu'elle mime une phosphorylation permanente du site concerné sur la protéine. Ainsi vous pouvez voir ce que cela provoque sur les rôles suspectés de cette phosphorylation. L'inverse est possible en mutant la sérine ou thréonine en alanine ou en cystéine. Cela rend le site inphosphorylable et permet donc d'étudier l'importance de cette phosphorylation de façon complémentaire à la mutation phosphomimétique. Néanmoins, les propositions de ce paragraphe sont des manips avancées dans l'étude d'une phosphorylation, elle se font donc généralement après la démonstration par marquage métabolique.

Une fois tout ceci fait, et si cela s'avère positif, alors votre manip en 32P aura plus de chance d'être fructueuse.

Greg

Edit : désolé je n'avais pas bien regardé la séquence consensus : c'est une thréonine qui est phosphorylée. Ce qui explique mon hésitation dans mon message sur sérine et thréonine.

[A voir en vidéo sur Futura]