Extraction ARN

[invitea14a6495]

Bonjour à tous!

Alors voilà je vous expose mon problème.
Je suis actuellement en train d'extraire des ARN viraux par méthode double extraction trizol-trizol LS et lorsque j'ai effectué la migration sur gel, je n'observe que très rarement les deux bandes caractéristiques à 18s et 28s. Normalement, je devrais observer deux belles bandes pour chaque échantillons puisqu'après quantification, j'ai pu voir que mes ARN étaient en concentration satisfaisante ( entre 0.5 et 1.8 µg/µL).
J'ai cherche donc à savoir d'où peux venir ce problème.
Parmis mes reflexions, je me demandais si mes ARN étaient convenablement solubilisés ( 10min à 65°C) et si il était possible que je les résolubilisent "un petit coup" avant de réaliser la migration sur gel.
Qu'en pensez vous?

merci d'avance!
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[akla]

Bonjour,

Pourriez-vous nous décrire un peu votre protocole afin d'éliminer certaines possibilités?

Cordialement

[invitea14a6495]

Bonjour, oui je vais vous detailler mon protocole
Alors, j'extrait des ARN à partir de morceaux d'organes de poulets conservés dans du RNA later à -80°C.
J'utilise une méthode de vibro-broyage en mettant l'organe dans un petit tube 1,5mL contenant 1mL e trizol et 500µL de billes permettant le broyage.
Le broyage dure environ 25minutes.

Ensuite le protocole est le suivant:

-200µL chloroforme + 1mL broyat
-Glace 15 minutes
-Centrifugation 12000g pdt 15min
-600µL trizol LS + 160µL chloroforme + 600µL surnageant contenant ARN
-Vortex 30s
-Glace 5min
-Centri 12000g 4°C 15min
-500µL isopropanol + 500µL phase supérieure
-Homogeneisation par retournement
-10min T°C ambiante
-Centri 12000g 4°C 15min
-Retirer surnageant + 1mL éthanol 75%
-Vortex pour décoller culot
-Centri 12000g 4°C 15min
-Retirer éthanol et laisser sécher culot (au moins 40min)
-Reprise culot dans eau DEPC
-Glace 30min
-Solubilisation 10min à 60°C

Voilà, ensuite je réalise une quantification et je fais migrer mes ARN sur un gel d'agorose à 1-1.2% à 50V pendant 30min (pas plus sinon mes bandes disparaissent).

Merci de votre aide !

[akla]

Bonjour,

premièrement 2 règle de base: l'utilisation de gants et garder l'ARN dans la glace (juste pour me le rappeler à moi même aussi car dieu sait qu'elles sont importantes)

Le fait que vous ayez déjà obtenue des bandes et que subséquemment le problème c'est manifesté, personnellement je vérifierait premièrement si il y a eu changement dans les solutions utilisées avant et après. Aussi d'autres questions comme;

Est-ce un problème de dégradation et de contamination par les Ribonucléases comme c'est si souvent le cas. Il est évidemment important d'utiliser tout le matériel RNase free et ce même pour le gel. Est-ce relié a la teinte, par exemple à certains moment le bromure d'éthidium (0,5 µg/mL) n'est pas utilisé a une quantité suffisante dans le gel certains vont même l'ajouter au tampon d'électrophorèse. Assurez vous d'utiliser un bonne épaisseur de gel approximativement de 0,5 cm pour éviter la diffusion de l'ARN lorsqu'il est trop épais. Aussi je ne connait pas la taille de votre gel mais 5 Volt/cm est recommandé par certains.

Juste un petit commentaire concernant le séchage de 40 minutes l'ARN, il est préférable d'enlever le maximum d'ARN pour éviter une période de séchage trop longue. D'autre cause moins probable comme une période d'exposition trop longue a l'U.V. peut dégradé l'ARN etc.

cordialement

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea14a6495]

Bonjour,

Tout d'abord merci de votre réponse .
Alors, il va de soit que j'effectue mon travail toujours en changeant de gants réguliérement et dans la glace mais vous avez raison de rappeller ces règles de bases

Pour les solutions que j'utilise, il n'y a pas eu changement depuis que j'ai commencé les extractions. Ce sont des solutions neuves que j'utilise.

Bien sur, j'utilise du matériel RNase free.
Pour le BET, j'en utilise à raison de 3µL pour 50mL et je l'ajoute lorsque je prépare le gel d'agarose .
Autre remarque, mon gel est de la bonne épaisseur comme vous le préconisez.
Néanmoins je pense que si le problème venait du gel, je ne verrais pas du tout de bandes; en effet, pour certains échantillons j'observe les bandes 18s/28s.

Pour le séchage du culot d'ARN, je suppose que vous vouliez dire qu'il faut enlever le maximum d'éthanol (et non pas ARN) pour que le séchage se fasse plus rapidement.

Hier j'ai essayé de refaire migrer des échantillons en faisant resolubiliser un peu les culots ( 10min à 65°C). Le profil que j'obtient est différent de celui que j'obtenais au départ : je vois pratiquement que des doubles bandes après une resolubilisation ce qui est positif puisqu'au départ je ne voyais presque pas de doubles blandes!

Je pense donc, qu'il faut que je refasse migrer tous mes ARN que j'ai extrait en faisant au préalable une nouvelles solubilisation car il faut que mes ARN soient ok pour que je continue ma manip.
Qu'en pensez vous?

Merci!

Cordialement .

[akla]

Néanmoins je pense que si le problème venait du gel, je ne verrais pas du tout de bandes; en effet, pour certains échantillons j'observe les bandes 18s/28s.

ah je pensait que le problème était alternatif

Pour le séchage du culot d'ARN, je suppose que vous vouliez dire qu'il faut enlever le maximum d'éthanol (et non pas ARN) pour que le séchage se fasse plus rapidement

.Oui c'est ça

Hier j'ai essayé de refaire migrer des échantillons en faisant resolubiliser un peu les culots ( 10min à 65°C). Le profil que j'obtient est différent de celui que j'obtenais au départ : je vois pratiquement que des doubles bandes après une resolubilisation ce qui est positif puisqu'au départ je ne voyais presque pas de doubles blandes!

Et bien si ça marche tant mieux , alors essayer de mélanger à des intervalle de 2 min en pipettant. Et n'oubliez par le temps de séchage de l'éthanol réduisez le au maximum si possible.

Cordialement

[chopinbiologiste]

comment se fait le choix de la température de solubilisation?(extraction ARN)