Projet de clonage

[invitec8d9247b]

Boujour a tout le monde,

ce trimestre on fait un projet de clonage du gen-gfp dans pcDNA3.1 et calculer l expression du transgene le gfp gen doit etre apres le CMV promoteur. on doit faire une strategie de clonage ( on est a 7 en groupe) chaqu un doit pense a une strategie et apres on va comparer les resultats. jai fait une strategie et jai besoin de vos commentaires s.v.p.

alors. on va digester leplasmide contenant le gfp gen pour extraire ce dernier. on va aussi digester le vecteur pcDNA3.1
il faut aussi faire une electroforese pour savoir le volume des fragments ( combien de bases contient chaque fragment)
on doit faire une ligation pour inserer le gfp gen dans le vecteur.
on fait une transformation des cellules et on fait incuber les bacteries.

est ce que ma strategie est logique et correct?
merci davance/
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[Flyingbike]

dans le principe c'est bon, mais ensuite il faut que tu connaisses les cartes de restriction des vecteurs pour voir le sites disponibles et déterminer si tu peux faire un clonage orienté et cohésif de ton gene. Il faut aussi que tu sois plus précis, par exemple pour les bactéries, il faut que tu sois capable de déterminer si les bactéries ont intégré la construction, tu vois de quoi je parle ?

[invitec8d9247b]

bonjour tous,
je narrive pas a realiser le principe du projet, comme c est en neerlandais je vais le traduire mot par mot pour que vous puissez maider.
"comme controle de lexpression in vitro (dans 3T3 cellules) il faut construire le suivant: clonez le gfp gen dans le plasmide pcDNA3.1 apres le CMV promoteur. c est un promoteur virale qui est actif dans toutes les cellules eukaryotes. controlez avec les enzymes de restrictions le nouveau plasmide: pcDNA3.1-GFP."
cest ce quon doit faire,
j ai cherche beaucoup sur le net mais cest devenu plus difficile.est ce quil ya quelquun qui peut maider, je nage vraiment.
je vais ecrire ce que je pense et apres vous pouviez me dire si suis je dans le bon sens or not.
le plasmide pcDNA3.1 est fourni par le firma invitrogen, et lautre aussi qui contient le gfp gen. donc on coup les deux plsmides au niveau du MCS par deux differentes enzymes. electroforese sur gel
on fait ensuite une ligation, une transformation et selection.
apres la transfection je ne sais ce qu on va faire?
et autre chose on a le plasmide pcDNA3.1(-) et (+), je ne sais ce que veut dire?
et comment choisir le bon site pour couper? je fais le choix mais je sais si s est le bon.
et puis comment faire le nouveau plamside penetrer les cellules 3T3?
ou bien cette phase n est pas necessaire? dapres mes idees je pense que si le plasmide fonctionne dans la bacterie il va aussi sexprimer dans le fibroblast. et donc la phase de transfection nest pas necessaire. est ce que cest juste ce que je pense?

s.v.p jattend vos reponses.

[invitec8d9247b]

personne veut maider jai besoin de vos reponses je nage vraiment

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

pour commencer tu dois digérer ton vecteur pCDNA et le gene GFP avec une ou deux enzymes de restrictions identiques pour que les extrêmités soient cohésives. Tu connais les cartes de resctriction de tes vecteurs ?

[invitec8d9247b]

salut, oui jai les cartes suivantes, pGEX261/GFP, pcDNA3.1(+/_),pEGFP-N3.
Merci,

[invitec8d9247b]

il y a quelqu un????????????????

[invite30157012]

La stratégie globale est bonne mais comme on te l'a déjà dit plus haut, tu dois choisir des sites de restrictions compatibles pour que la ligation fonctionne.
- D'après les cartes que tu as, quelles enzymes as-tu choisies?
- Après la transformation comment sélectionnes-tu les bactéries qui sont transformées?
- Enfin on te demande de vérifier ta construction PCDNA3-GFP une fois que tu l'auras obtenue, c'est-à-dire que tu dois trouver une ou plusieurs enzymes de restriction qui te donneront un résultat différent en fonction de si tu as ton insert ou non. Par ex le choix d'une enzyme pour laquelle tu as 1 site dans ton vecteur PCDNA et un site supplémentaire dans ton insert est idéal car tu auras 1 bande = ton vecteur linéarisé si ton vecteur ne contient pas l'insert, et 2 bandes avec des poids moléculaires bien précis si tu as bien ton insert.

[invitec8d9247b]

bonjour, Merci Delphinette,
on a aujourdhui parle de la strategie, pour les enzymes jai choisi le KpnIet BamHI. est ce qu il est necessaire de faire l isolation du plasmide de pcDNA3.1 au premier pour obtenir les plasmides.
est ce que on va utiliser le bleu/wit screening pour la selection?

Merci davance, Merayoub