[Biologie Moléculaire] éléctrophorèse et PCR
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éléctrophorèse et PCR



  1. #1
    invite59cd858d

    Question éléctrophorèse et PCR


    ------

    bonjour
    aidez moi SVP , j'ai du mal à comprendre

    1-après avoir fait la PCR comment confrimer si l'amplification a bien eu lieu sur le gel

    2-je compte préparer du TBE 0,5X à partir de la solution commérciale 10X

    10X-----------------1000ml
    0,5X---------------- n

    donc n=1000 x 10/0,5=50ml
    alors à 50ml je complète 950 d'eau pour arriver à 1l ?
    est ce que ma démarche est juste?
    je pense que je me trompe car je connai pas le principe

    -----

  2. #2
    piwi

    Re : éléctrophorèse et PCR

    Le résultat est juste mais la manière de présenter le raisonnement est fausse.

    vous voulez 1L de TBE 0.5X que vous préparez à partir d'une solution mère TBE 10X.
    Deux manières de voir les choses.
    1. 1000ml x 0.5X = ?ml x 10X ==> ? = 50ml
    2. Pour passer de 10X à 0.5X je dilue 20 fois. 1000ml/20 = 50ml.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  3. #3
    invite59cd858d

    Re : éléctrophorèse et PCR

    merci beaucoup pour votre réponse
    pour la première méthode je dois appliquer cette relation : Vi x Ci= Vf X Vf
    si j'ai compris , si je souhaite préparer une solution de 500ml à 0,5X de TBE à partir de 10X je procède ainsi : 500 x 0,5 = N x 10 donc N = 25 ml
    et j'ajoute 475 ml d'eau pour arriver à 500ml de TBE 0,5X
    je me trompe ??

    pourriez vous développer un plus la deuxième méthode car c’est pas très clair
    merci d’avance pour votre aide

  4. #4
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : éléctrophorèse et PCR

    oui c'est ca. Pour la 2eme methode c'est celle que j'utilise (c'est a dire plusieurs fois par jour).
    En gros tu prends la concentration de ton stock (par exemple 500mM) : Ci
    La concentration finale souhaitée, exemple 50mM : Cf
    Tu peux calculer entre les deux concentrations un facteur de dilution fd : ici 500/50 = 10.

    Ensuite pour préparer ta solution de volume total V il faut prélever V/fd de ta solution stock.

  5. A voir en vidéo sur Futura
  6. #5
    invite59cd858d

    Re : éléctrophorèse et PCR

    merci du fond du coeur
    n'auriez vous pas de réponse pour la deuxième question "la PCR"

  7. #6
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : éléctrophorèse et PCR

    1-après avoir fait la PCR comment confrimer si l'amplification a bien eu lieu sur le gel
    Ben normalement, pour la plupart des PCR, tu connais la taille attendue de ton produit. Il te suffit de déposer un peu de ton mix de PCR sur un gel dont la concentration en agarose est adaptée à la taille du produit que tu veux voir (par exemple s'il fait 200pb tu fais un gel a 3%, si'l fait 1000 tu fais un gel a 1%, etc...). Ne pas oublier de faire co-migrer un marqueur de taille. A la fin de la migration il te suffit de vérifier que ton produit est présent et unique (spécificité d'amplification) et a la taille attendue (par rapport au marqueur de taille).

  8. #7
    invite59cd858d

    Smile Re : éléctrophorèse et PCR

    ok j'ai compris merci merci beaucoup

  9. #8
    invite899b80e1

    Re : éléctrophorèse et PCR

    Un gel à 3%, ca me parait excessif pour séparer un produit de 200pb, je suppose que le temps migration doit être assez grand? Personnellement pour 200pb, 1,5% suffit largement à 100V 25min. Enfin c'est mon avis

  10. #9
    Flyingbike
    Modérateur*

    Re : éléctrophorèse et PCR

    Tu as tout a fait raison, pour vérifier la présence d'un produit de 200pb tu peux très bien le voir sur un 0,8% aussi.
    Par contre pour ma part quand je fais des PCR de génotypage, je dois différencier un produit de 150 et un de 165, donc pour augmenter le pouvoir discriminatoire du gel donc dans ce genre de cas il faut un gel plus concentré.

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