Dilution PCR

[invite59cd858d]

salut à tous
j'ai un TP de PCR et je ne sais pas comment faire les dilutions des dNTP, des amorces...la règle utilisée est bien CiVi=CfVf ?
pourriez vous me donné un exemple SVP
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[piwi]

Et bien si vous souhaitez de l'aide donnez vos données initiales. Au moins...

Sinon, classiquement les dNTP sont préparés en un mélange 10mM, dilués de sorte à être utilisés à 1mM. Dès lors ce n'est pas bien sorcier. 10mM --> 1mM dilution d'un facteur 10. Si votre volume réactionnel est de V, vous mettez V/10 de votre solution stock.

Cordialement,
piwi

[Flyingbike]

oui c'est ca. Ex : ton tube d'amorces est a 10µM, et tu dois avoir une concentration finale de 500nM. Combien en prélèves tu sachant que le volume réactionnel total est de 50 µL ?

[invite59cd858d]

merci de m'avoir répondu
j'si j'ai pas donné des valeurs c parseque je ne les aient pas
bon si j'ai bien compris la réponse est de 25µl
j'ai fait 10µM * Ci=500nM*50µl
donc Ci= 0.5µl*50µl/10µl=25µl

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

Attention, c'est Vi que tu cherches :

Vi (volume a prélever) = Cf * Vf / Ci
=500nM*50µL/10000nM
=2,5µL !

[invite59cd858d]

merci de m'avoir répondu
j'si j'ai pas donné des valeurs c parseque je ne les aient pas
bon si j'ai bien compris la réponse est de 25µl
j'ai fait 10µM * Ci=500nM*50µl
donc Ci= 0.5µl*50µl/10µl=25µl

ooooooooooops mon message est allé trop vite

[piwi]

Bonjour.

CiVi = CfVf
Ci = 10µM-------Cf = 500nM = 0.5µM
Vi = ?-----------Vf = 50µl

Donc,
10µM x ? = 0.5µM x 50µl et ? = 2.5µl

Sinon, de manière presque plus instinctive vous pouvez noter que vous passez de 10µM à 0.5µM. Donc vous avez un facteur de dilution de 20.
Du coup il faut mettre 1/20 de la solution stock dans la solution finale pour arriver à la bonne concentration. 50µl/20 = 2.5µl

Pour la PCR les concentrations que l'on rencontre (en tout cas moi) souvent, sont:
Mix PCR 10X -------------------------------------------------> 1X
Mix dNTP 10mM ----------------------------------------------> 300µM
Oligo #1 100mM ou 1µg/µl (~175µM pour un 20 mer) -----------> 0.5µM
matrice:
Si plasmide 1pg à 10ng
Si genomique 1ng à 250ng
Taq ----------------------------------------------------------> 0.1u/µl

Cordialement,
piwi

[invite59cd858d]

grand merci à vous tous, pour le calcule j'ai bien compris (j'ai envoyé trop vite , et c pas ci mais plutot vi) mais l'essentiel c'est c clair et grace à vous

[invite0a3fba27]

Bonjour.

CiVi = CfVf
Ci = 10µM-------Cf = 500nM = 0.5µM
Vi = ?-----------Vf = 50µl

Donc,
10µM x ? = 0.5µM x 50µl et ? = 2.5µl

Sinon, de manière presque plus instinctive vous pouvez noter que vous passez de 10µM à 0.5µM. Donc vous avez un facteur de dilution de 20.
Du coup il faut mettre 1/20 de la solution stock dans la solution finale pour arriver à la bonne concentration. 50µl/20 = 2.5µl

Pour la PCR les concentrations que l'on rencontre (en tout cas moi) souvent, sont:
Mix PCR 10X -------------------------------------------------> 1X
Mix dNTP 10mM ----------------------------------------------> 300µM
Oligo #1 100mM ou 1µg/µl (~175µM pour un 20 mer) -----------> 0.5µM
matrice:
Si plasmide 1pg à 10ng
Si genomique 1ng à 250ng
Taq ----------------------------------------------------------> 0.1u/µl

Cordialement,
piwi

Après le souci de la suspension des oligo que j'ai, heureusement, finalement compris je n'arrive pas à trouver la quantité de l'enzyme (herculase pour mon proto) à mettre dans mon mix de 50ul. si la concentration de l'enzyme est de 5U/ul et qu'il me faut 5U pour mon volume total de 50ul je dois mettre 250ul ?! à quoi correspondent les 250U d'enzyme en volume (ul) c'est dire combien de ul je dois prendre avec la pipette ?!!
Qu'elle est la calcul à faire

Merci pour votre aide

[piwi]

si la concentration de l'enzyme est de 5U/ul et qu'il me faut 5U pour mon volume total de 50ul je dois mettre 250ul ?! à quoi correspondent les 250U d'enzyme en volume (ul) c'est dire combien de ul je dois prendre avec la pipette ?!!

Le calcul doit pouvoir être fait par un élève de 8-10 ans... Moi je veux bien aider, mais il faut aussi que de l'autre coté les personnes y mettent du leur. Vous avez une enzyme dont la solution stock est de 5U/µL et vous vous demandez combien de µl il faut prendre pour avoir 5U. J'espère que c'est une blague!
On vous demande combien de µL à 5U/µL vous devez prendre pour avoir 250U. Vous ne savez pas faire une division?

piwi

[invite853321bf]

De mon DEUG jusqu'à ma maitrise, chaque année aux exams écrits de TP, j'avais à résoudre ce genre de petits calcul. Et honnêtement ça revient tous les jours à la paillasse en BM.

On ne vous a jamais présenté l'équation C = n / V ?

[invite0a3fba27]

Le calcul doit pouvoir être fait par un élève de 8-10 ans... Moi je veux bien aider, mais il faut aussi que de l'autre coté les personnes y mettent du leur. Vous avez une enzyme dont la solution stock est de 5U/µL et vous vous demandez combien de µl il faut prendre pour avoir 5U. J'espère que c'est une blague!
On vous demande combien de µL à 5U/µL vous devez prendre pour avoir 250U. Vous ne savez pas faire une division?

piwi

Merci ... c'était pour confirmer que 5U/ul était bien la concentration de l'enzyme.

...Kamor merci pour ta participation !! Je débute en pratique !