Comment déterminer le rendement d'une RT?

[invite44f8195c]

Salut!

Voilà, j'ai eu a faire une RT-PCR en travaux pratiques et la prof nous a posé une colle: Comment on peut déterminer le rendement de la transcription inverse?
Apparement il y a une méthode assez compliquée à mettre en oeuvre donc on ne s'en sert quasiment jamais mais...impossible de la trouvée =/
J'ai fouillé un peu partout sur internet (sur le forum aussi) mais personne ne parle jamais de cette fichue méthode!
Pourtant, elle doit bien exister (à moins que ce soit une blague pas très drôle de notre prof mais j'en doute)

Donc si quelqu'un en a entendu parlé, qu'il vienne éclairer ma lanterne, pitié!!
lol

Merci d'avance et bonne soirée!
Miss Titch@
-----

[invite4ff9937a]

Salut,

Pour savoir si la RT à bien marché on fait une PCR sur un gène de ménage, c'est un dire un gène qui est toujours exprimé à un taux maximale dans la cellule du genre l'actine car tu sais forcément que tu as du générer du cDNA pour ce gène.

Maintenant pour déterminer le rendement sa veux dire être capable de dire ma RT à marché à 25%;50%;ou à 100% et la je ne vois pas bien....Mais je ais y réfléchir toute la nuit

peut-être à demain donc

[invite4ff9937a]

re

En fait je suis en train de me dire que si tu doses ou determine avant et après ta quantité d'acide nucléique tu peux connaitre le rendement.

En effet avant tu as QUE de l'ARN une quantité X après la RT si tu as une éfficacité de 100 tu as une quantité d'acide nucléique de 2X (1brin d'ARN + 1 brin d'ADNc).
Donc avec un produit en croix (l'arme mathématique de tout bon biologiste.lol) tu peux determiner le rendement de ta RT.....

Voila 1er solution

[gorben]

Salut,
La seule methode pour determiner un rendement de RT est de rajouter un ARN de synthese pur et de quantitee connue. Si tu sais combien tu met de cet ARN au depart, tu va le traiter comme les autres lors de la RT et lors de ta PCR tu va quantifier ton ADNc provenant de cet ARN en meme temps que tes echantillons. Si tu fais le rapport ADNc/ARN tu devrais trouver ton rendement de RT.
Ce qui est chiant c'est de trouver un ARN dont tu es sur qu'il n'a aucun competiteur dans ton echantillon. Certaines compagnies on speciallement cree ce genre d'ARN qui n'a d'homologue chez aucune espece sequence a ce jour. Forcement, c'est rare donc c'est cher...
A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite44f8195c]

Merci beaucoup à vous deux!
En effet, la méthode avec l'ARN de synthèse a l'air un peu plus dur à mettre en oeuvre mais j'ai peur qu'avec le dosage des acide nucléique, on mesure en même temps les nucléotides libres issues de la dégradation de l'ARN alors c'est peut-être bien la première la plus juste...
Je vais voir si ma prof veut bien laisser filtrer quelques infos de plus, lol.

Merci encore et bonne journée

[invite4ff9937a]

Salut

En ce qui concerne l'ajout d'un ARN de synthése. Soit
mais j'ai deux remarques: si tu met un ARN de synthése l'efficacité de la transcription sur celui ci peut dans certain cas ne pas refléter l'eficacité de la RT sur l'ensemble de la population des ARN de l'echantillon.
Deuxièmement, puisque on fait ADNc/ARN après la PCR qui nous dis que la PCR à été efficace à 100% pour ne pas biaiser la quantification du rendement de la RT?

Bon j'ai pas eu le temps de bien formuler sa donc j'ai l'impression que c'est un peu brouillon dsl mais j'ai pas trop de temps là.

[gorben]

Salut,

En ce qui concerne l'ajout d'un ARN de synthése. Soit
mais j'ai deux remarques: si tu met un ARN de synthése l'efficacité de la transcription sur celui ci peut dans certain cas ne pas refléter l'eficacité de la RT sur l'ensemble de la population des ARN de l'echantillon.

J'ai pas dis que c'etait parfait, il y a toujours des "imprevus". Il peut tout a fait y avoir certains cas ou la RT a des rendements differents selon les cibles... d'un autre cote, tu auras aussi le probleme (et probablement encore plus marque) entre deux ARNm differents. Faut il conclure que la manip de RT est une manip obsolete qui ne permet aucune conclusion? Non, mais tout le monde est conscient des limites de la methode. Maintenant, quand je lis un papier, entre une quantif sans temoin RT et une avec, j'ai quand meme tendance a prendre celle avec le temoin un peu plus au serieux

Deuxièmement, puisque on fait ADNc/ARN après la PCR qui nous dis que la PCR à été efficace à 100% pour ne pas biaiser la quantification du rendement de la RT?

La par contre, avant la qPCR tu es sense avoir verifie que ta reaction est correcte, sans dimere de primer et avec un facteur 2 entre chaque cycle. Si la qPCR n'est pas quantitative, c'est la faute de l'utilisateur qui a mal fait son boulot

A+