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Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?



  1. #1
    thala

    Question Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?


    ------

    Bonjour et Bonne Année à tous,

    Voilà, jaimerais savoir comment on detérmine pratiquement l'activité enzymatique d'une kinase?
    D'aprés ce ke j'ai lu on peut utiliser in-vitro: la kinase, de l'ATP marqué, Mg2+ je crois, et la proteine substrat (ou juste un peptide synthétique commercial recouvrant le site de phosphorylation.
    Mais si c'est ça, comment on fait pour QUANTIFIER le taux de phosphorylation.
    J'espére ke c'est assez clair (désolé); je vous remercie d'avance.
    N'hésiter pas.

    -----

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  3. #2
    Yoyo

    Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    Salut

    en fait il faut voir si tu veux determiner l'activité in vivo ou in vitro, il faut savoir qu'in vitro les kinase sont vraiment pas spécifiques et phosphorylent un peu n'importe quoi... seule une preuve in vivo pourra convaincre des referee

    Yoyo

  4. #3
    thala

    Thumbs up Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    :est ce ke kelkun peut m'aider.
    Merci

  5. #4
    Yoyo

    Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    Citation Envoyé par thala Voir le message
    :est ce ke kelkun peut m'aider.
    Merci
    ecrit comme ca cela m'etonnerait beaucoup!
    tu aurais au moins pu répondre a mon message!....

    Yoyo

  6. A voir en vidéo sur Futura
  7. #5
    thala

    Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    Merci pour ta réponse (désolé j'avais pas vu)

    en fait l'éxperience doit se faire in-vitro; pas de probléme de non-spécificité car dans le milieu in n' y aura que (pratiquement) la kinase et son substrat car tous deux s'appretent aux techniques de purifications (d'ailleurs la kinase est produite tagguée en grande qté dans des bacteries)

  8. #6
    thala

    Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    Désolé encore une fois;
    j'ecrivais mon message 22:55 en mçeme temps que toi 22:53.

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  10. #7
    Yoyo

    Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    c'est dans le cadre d'un exercice? si oui tu n'as aucune autre donnée?

    Meme pure une kinase in vitro n'est pas spécifique.
    Sinon si tu connais le nombre de molécules de substrat mis dans le tube en presence de kinase, que tu connais la quantité de kinase mise et que l'ATP radioactif n'est pas limitant, alors en déterminant la quantité de radioactivité incorporée dans les proteines tu dois pouvoir en deduire une activité spécifique.

    YOyo

  11. #8
    thala

    Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    merci encore
    Justement c'était ma question (formulée autrement je l'avoue (moins professionelle)) comment quantifier l'incorporation de la radioactivité dans la proteine?

  12. #9
    Yoyo

    Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    Pour quantifier la radioactivité incorporée dans les proteines, tout d'abord tu précipites les proteines a partir du mélange reactionnel, histoire de te debarasser de la radioactivité non incorporée.
    Puis tu quantifies en utilisant un compteur a scintillation. ca te permet ainsi d'avoir le nombre de coups par minute (cpm)

    Yoyo

  13. #10
    thala

    Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    Je te remercie pour ta réponse
    si peux me le permettre juste une dernierre question;l'unité de l'activité enzymatique dans ce cas là elle est exprimée en quoi?

  14. #11
    Yoyo

    Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?

    Citation Envoyé par thala Voir le message
    Je te remercie pour ta réponse
    si peux me le permettre juste une dernierre question;l'unité de l'activité enzymatique dans ce cas là elle est exprimée en quoi?
    tu mesures des cpm, comme tu as laissé la kinase agir un certain temps, il y a des minutes, et une concentration de protéines.
    Ca donne donc des cpm par min et par mol de kinase

    YOyo

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