Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?
Bonjour et Bonne Année à tous,
Voilà, jaimerais savoir comment on detérmine pratiquement l'activité enzymatique d'une kinase?
D'aprés ce ke j'ai lu on peut utiliser in-vitro: la kinase, de l'ATP marqué, Mg2+ je crois, et la proteine substrat (ou juste un peptide synthétique commercial recouvrant le site de phosphorylation.
Mais si c'est ça, comment on fait pour QUANTIFIER le taux de phosphorylation.
J'espére ke c'est assez clair (désolé); je vous remercie d'avance.
N'hésiter pas.
Salut
en fait il faut voir si tu veux determiner l'activité in vivo ou in vitro, il faut savoir qu'in vitro les kinase sont vraiment pas spécifiques et phosphorylent un peu n'importe quoi... seule une preuve in vivo pourra convaincre des referee
Yoyo
Re : Comment déterminer l'activité d'une kinase en pratique.?
:est ce ke kelkun peut m'aider.
Merci
ecrit comme ca cela m'etonnerait beaucoup!Envoyé par thala
Merci
tu aurais au moins pu répondre a mon message!....
Yoyo
Merci pour ta réponse (désolé j'avais pas vu)
en fait l'éxperience doit se faire in-vitro; pas de probléme de non-spécificité car dans le milieu in n' y aura que (pratiquement) la kinase et son substrat car tous deux s'appretent aux techniques de purifications (d'ailleurs la kinase est produite tagguée en grande qté dans des bacteries)
Désolé encore une fois;
j'ecrivais mon message 22:55 en mçeme temps que toi 22:53.
c'est dans le cadre d'un exercice? si oui tu n'as aucune autre donnée?
Meme pure une kinase in vitro n'est pas spécifique.
Sinon si tu connais le nombre de molécules de substrat mis dans le tube en presence de kinase, que tu connais la quantité de kinase mise et que l'ATP radioactif n'est pas limitant, alors en déterminant la quantité de radioactivité incorporée dans les proteines tu dois pouvoir en deduire une activité spécifique.
YOyo
merci encore
Justement c'était ma question (formulée autrement je l'avoue (moins professionelle)) comment quantifier l'incorporation de la radioactivité dans la proteine?
Pour quantifier la radioactivité incorporée dans les proteines, tout d'abord tu précipites les proteines a partir du mélange reactionnel, histoire de te debarasser de la radioactivité non incorporée.
Puis tu quantifies en utilisant un compteur a scintillation. ca te permet ainsi d'avoir le nombre de coups par minute (cpm)
Yoyo
Je te remercie pour ta réponse
si peux me le permettre juste une dernierre question;l'unité de l'activité enzymatique dans ce cas là elle est exprimée en quoi?
tu mesures des cpm, comme tu as laissé la kinase agir un certain temps, il y a des minutes, et une concentration de protéines.
Ca donne donc des cpm par min et par mol de kinase
YOyo
