Bonjour,
Alors je vous expose mon problème:
On cherche à obtenir une co-ip de 2 protéines transmembranaires (cellules eucaryotes) sachant que l'une d'elle a besoin d'être dénaturée et l'autre ne doit pas l'être...
Si vous avez des idées, n'hésitez pas!
Merci.
C'est in vitro ( protéines purifiées ) ? In vivo (extraits cellulaires?)
Après sur le fond, ça me regarde pas mais je vois mal l'intérêt de montrer l'interaction avec 1 protéine dénaturée.
Il s'agit d'un lysat cellulaire.
La protéine 1 est assez grosse (160kd) et elle ne doit pas être dénaturée car sinon elle reste en tapon dans les puits de loading. La protéine 2 est plus petite et n'a pas ce problème. D'habitude on la dénature pour la voir en western, mais en l'occurence on peut faire sans.
En fait je me suis mal exprimé.
En fait c'est pour éluer les protéines des billes marquées que l'on doit chauffer.
Conséquence, soit on ne chauffe pas du tout et on ne décroche pas les protéines des billes, soit on chauffe pour éluer et du coup on dénature notre protéine 1 qui du coup ne peut plus migrer sur notre gel...
Des idées?
C'est un peu confus...
Votre protéine de 160kd vous la passez sur SDS PAGE telle quelle ? sans la dénaturer ... Si vous la dénaturez elle rentre pas dans le gel ? ca n'a pas de sens c'est l'inverse ... Quel est le %age du gel ?
Dites en nous plus.
