Extraction ARN Lignée cellulaire et Bactérie

[invite899b80e1]

Bonjour à tous,
J'aimerai profiter de votre savoir vis à vis de l'extraction d'ARNm dans le cas suivant : Je vais mettre en culture des bactéries (lactique) sur des cellules (HT-29) pendant quelque. En fin de cinétique j'aimerai pouvoir isoler l'ARN Bactérien ainsi que l'ARN eucaryotes. J'ai regardé un peu ce qui se fait et bien souvent, il s'agit d'une extraction ARN classique qui inclue les deux ARN. J'ai également remarqué qu'il était aussi possible d'éliminer 90% de l'ARN eucaryotes avec un système de colonne mais là j'avoue que j'ai peur du prix (je me trompe peu être). Enfin bref qu'es qui vous semblent le mieux :
_travailler sur un mélange d'ARN (bruit de fond énorme?) ou
_travailler sur deux ARN bien séparé (perte de la quantité de transcrit ?)


Merci pour votre aide
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[piwi]

Je vais peut être dire une bétise ici, mais en remettant les cellules en suspension et en les filtrant sur une unité à mailles pas trop grosses (<5-10µm), n'y a t-il pas moyen de séparer les bactéries des cellules afin d'extraire séparément les ARN des deux populations?

Cordialement,
piwi

[invite2ac96057]

même si je ne vois pas bien l'intérêt de mettre des bactéries en culture sur des cellules si tu veux séparer les ARNm distinctement pourquoi ne pas essayer une centrifugation. Ensuite tu extraits une des deux ou les deux phases et tu fais ton extraction ....
Sur ce coup j'ai peut être un point de vue simpliste mais je ne vois pas pourquoi ça ne fonctionnerai pas .... les bactéries étant plus petites que les cellules humaines

[invite899b80e1]

J'y ai effectivement pensé mais j'ai peur d'abimer les cellules avant d'attaquer l'extraction.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite899b80e1]

oui j'ai aussi penser à la centrifugation mais la dans le cas de cellules je ne sait pas si les organites vont se lyser et l'ARN se dégrader .
PS:L'objectif de cette manip c'est de voir la communication cellules/bactéries

[piwi]

Ne vous inquietez pas pour vos cellules. Vous n'allez pas les centrifuger à 100 000 rpm. En revanche je ne sais pas si il est simple de faire une centri differentielle entre les bactéries et les cellules à basse vitesse (< 10 000 rpm). C'est pour cela que je suggérais un filtre.

Cordialement,
piwi

[invite2ac96057]

je fais de la culture cellulaire sur des HCT-8 et si je ne me trompe pas les HT-29 sont un type relativement proche. Les HCT-8 résistent à beaucoup de chose et se redéveloppent très bien après 1h de Trypsine et un petit tour à la centrifugeuse. Mais à mon avis de toute façon si tu ne veux pas suivre la technique sur colonne il va falloir que tu tatonnes un peu pour trouver une technique qui te convienne ... en plus c'est ça qui est drôle non?! ;p

[invite899b80e1]

héhé, je ne sais si j'irai jusqu'a drôle, mais c'est vrai que ca apporte du piment! je vais tester la méthode par centrifugation et je vais dénombrer les bactéries du surnageant ca me donnera une idée de ce que je perd. Merci de vos conseils

[invite853321bf]

Ca dépend aussi et surtout de ce que tu veux faire aussi de tes ARN après. RT-PCR en Taqman, si tes amorces et sondes sont bien faites, pas de problème normalement.
Si tu veux faire des techniques moins spécifiques, effectivement ça peut poser problèmes.
Une autre méthode serait un gel d'électrophorèse quantitatif en mesurant les quantités de 16S et 18S, mais tes chiffres seront peu précis