Comment faire tenir les HEK ?

[invite0e9887ab]

Bonjour à tous !


J'essaie désespérément de faire tenir mes HEK293T sur mon petit coverslip de verre.

Mais rien à faire. Même en faisant super attention, au moindre mouvement de milieu, elles se décollent par tapis. Si je les replace ensuite à 37°C, elles se redéposent, un peu plus loin évidemment, comme si de rien était.

Lorsque je les sème, j'incube mes plaques, avec coverslip, au préalable avec de la gélatine 0,1 % (j'ai mm essayé du 1%).

Il y a tellement de méthodes de coatage. En temps normale, la gellatine fonctionne bien. Mais là... Je ne sais pas quoi essayer.

Connaissez-vous l'astuce ?


Dizaal
-----

[piwi]

Il y a le coating en polylysine qui se fait beaucoup. Je ne sais pas ce que ça donne pour le HEK.
Sinon, si ça se décroche en tapis c'est peut être aussi parce que vos cellules sont trop confluantes. Asseyez d'ensemencer moins ou de cultiver moins longtemps.

Cordialement,
piwi

Note: c'est pour faire quoi?

[invite0e9887ab]

Merci. En effet, je n'avais pas essayé de modifier la confluence.

Je les transfecte avec des plasmides d'expression pour la GFP. Comme je fais mes transfections au Jet Prime, il est préférable d'avoir une bonne petite confluence.

Mais je vais peut-être retenter le coup avec de la transfectine (que nous utilisions pécédemment) en diminuant la confluence.

[invite0e9887ab]

En réalité, après avoir demandé confirmation, nous avons déjà testé de diminuer la confluence. Le problème reste le même.

La polylysine est plus efficace que la gélatine ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

En principe c'est plus adapté.
Sinon vous pouvez essayer de faire vos manip en labtek si vous souhaitez travailler sur de petits volumes. Ca ira peut être un peu mieux.

Cordialement,
piwi

[invite0e9887ab]

Bonjour !


Merci mille fois pour ce conseil. Cela s'est avéré payant.

En réalité, la technique avait déjà été testée au labo, mais cela fut très peu fructueux. La PLL laissait des "fils" qui se voyaient au microscope et empêchaient de regarder le résultat correctement.

En diminuant la concentration utilisée auparavant, l'adhérence est conservée et la PLL se voit beaucoup moins.

Voici donc ce que j'ai fait :

- Couvrir le fond du puits avec de la PLL 0,01 mg/ml
- Laisser 30 min à RT
- Laver 3x au PBS
- Semer les cellules

Certains préconisent également de laisser sécher toute la nuit à 37°C après le lavage au PBS, mais cela n'a rien changer ou presque chez moi.

C'est miraculeux. Je peux presque faire du up-and-down sans soucis dans mon puits (presque hein ! ^^).



Dizaal