Transfection Huv-ec-c

[invited0d05593]

Bonjour à tous !

Cela fait 4 semaines que je tente désespérément de transfecter des cellules Huv-ec-c (provenant d'ATCC, pas des cultures primaires) avec un plasmide pEGFP-N3 dans lequel est inseré l'ADNc codant pour ma protéine d'intérêt (et j'ai vérifié qu'il y était).

Après avoir tenter diverses conditions en lipofectamine (en faisant varier la concentration de transfectant ou d'ADN), je n'obtiens rien ou à la limite un bruit de fond...

Depuis cette semaine, je tente un nouveau transfectant qui est le jet-PEI Huvec (normalement pour culture primaire mais je ne vois pas pourquoi cela ne marcherait pas en cellules en lignée) et rebelote: rien du tout!

Entre temps, j'ai pu testé mes constructions plasmidiques sur d'autres cellules et là la transfection lipofectamine s'est bien realisée!

Donc voilà, j'en suis à un point où j'accepte toute recommandation et protocole qui marche.

Merci pour votre aide ! Et faites chauffer vos neurones !
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[piwi]

Est ce que vous avez fait varier la confluence de vos cellules? La qualité de transfection est très confluence dépendante. Sinon, vous entretenez cette lignée depuis longtemps? Parfois, en vieillissant les cellules se laissent moins transfecter. En général, on préfère faire les transfections sur des cellules récemment décongelées et remises en culture.

Sinon question completement idiote, mais bon. C'est un plasmide GFP, j'imagine que vous testez l'expression en GFP. Vous êtes certain que le plasmide est bon? Parce que si vous cassez la phase de lecture il n'y a pas de GFP.
De manière moins idiote, on peut aussi se dire que la transfection est OK mais que le plasmide n'exprime pas la GFP pour diverses raisons (exemple: La protéine de fusion modifie la conformation de la GFP et l'empeche de fluorescer...)

En conclusion, je transfecterais bien avec le plasmide vide qui exprimera à coup sur la GFP. Vous verrez bien.

Cordialement,
piwi

[invited0d05593]

Merci pour cette réponse rapide !
Donc pour reprendre les différents points évoqués:
- Il a bien été fait des tests à des confluences cellulaires différentes sans que cela ne change grand chose.
- Idem pour le passage cellulaire: nous nous sommes posés la même question au labo et donc les transfections ont été testé sur des cellules "toutes jeunes"
- Pour l'expression de la GFP, j'ai testé ces mêmes constructions dans un autre type cellulaire (Huh7, que je connais mieux et pour lesquelles je n'ai jamais eu de problème de transfection) et la protéine s'exprime bien avec son tag GFP.

Les différentes expériences de transfection ont été faites toujours avec le plasmide vide en parallèle...qui ne donne rien (enfin toujours un bruit de fond mais c'est partout).

Voila pour faire avancer la chose...
Encore merci pour ces premières idées !

[vpharmaco]

Bonjour,

il me semble qu'un de mes anciens collegues a deja eu à transfecter des cellules HUVEC (culture primaire). Je lui ai envoyé un mail. Je vous mettrais en contact si c'est le cas.

En dernier recours, tu peux mailer le Reseau Francais d'Angiogenese ;http://www.angiogenese.fr/2005_annuaire.html ... il y en aura bien un qui aura réussi a transfecter des huvec avec succes !

[A voir en vidéo sur Futura]