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Reverse transcription et amorçage avec hexamères aléatoires ?



  1. #1
    Koko76

    Reverse transcription et amorçage avec hexamères aléatoires ?


    ------

    Bonjour à tous, je viens d'apprendre qu'aujourd'hui, dans le cadre d'une reverse-transcription, on utilisait en complément des classiques amorces "oligo-dt" des hexamères aléatoires ...

    Je sais juste qu'il s'agit de séquences d'ADN artificielles très courtes, qui créent une amorce en milieu de séquence ...

    Pouvez vous m'en dire plus ( le principe, comment ça marche, à quoi ça sert ... ) sans rentrer dans les détails ?

    Un grand merci d'avance

    -----

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  3. #2
    Edelweiss68

    Re : Reverse transcription et amorçage avec hexamères aléatoires ?

    Bonjour,

    "Les amorces aléatoires sont de courtes séquences oligonucléotidiques synthétisées de façon aléatoire et comprenant 6 (hexamères), ou 8 (octamères) nucléotides. Ces amorces vont, statistiquement, avoir une chance de se fixer sur l'ensemble des ARN présents dans la matrice. L'amorçage aléatoire est très utilisé du fait de sa polyvalence. Il est recommandé pour la synthèse d'ADNc à partir d'ARNm fragmentés, d'ARN riches en structures secondaires, ou lorsque l'on souhaite amplifier plusieurs cibles à partir de la même préparation d'ADNc. En revanche, les amorces aléatoires pouvant se fixer à différents niveaux de l'ARN, la rétrotranscription est généralement incomplète et on obtient peu d'ADNc pleine longueur. On utilise en général des hexamères. Les octamères favoriseraient l'efficacité de l'amorçage en cas de RT à température élevée. La concentration en amorces aléatoires conditionne la taille des fragments d'ADNc synthétisés. En effet, la longueur moyenne des brins synthétisés est inversement proportionnelle à la concentration en amorces. La concentration d'amorces aléatoires doit donc être déterminée en fonction de la taille du fragment à amplifier. On peut utiliser des quantités d'hexamères allant de 20 ng (ADNc longs) à plus de 5 µg (ADNc courts) pour une réaction de 20 µL. Il faut noter que de fortes concentrations d'hexamères n'exercent pas d'action inhibitrice sur la RT."

    Source:http://www.john-libbey-eurotext.fr/f...type=text.html

  4. #3
    Koko76

    Re : Reverse transcription et amorçage avec hexamères aléatoires ?

    Merci beaucoup Edelweiss !

  5. #4
    Koko76

    Re : Reverse transcription et amorçage avec hexamères aléatoires ?

    Une toute dernière question.

    Dans la rétrotranscription, on a bien besoin d'ADN polymérase pour la synhèse du brin d'ADNc ?
    Comment cette ADN polymérase fait pour comprendre les "U" de l'ARN et synthètiser un "A" en face ?

  6. #5
    Guillaume69

    Re : Reverse transcription et amorçage avec hexamères aléatoires ?

    Bonsoir,

    Pour l'étape de RT, on utilise une enzyme particulière : la Reverse Transcriptase (transcriptase inverse en français), qui catalyse la transcription d'ADN à partir d'ARN. On dit que c'est une ADNpol ARN-dépendante.

    Comment cette ADN polymérase fait pour comprendre les "U" de l'ARN et synthètiser un "A" en face ?
    Comme pour toutes les enzymes, c'est une question d'accessibilité au substrat et de conformation spatiale.
    D'ailleurs, ce n'est pas tant le "problème" de la complémentarité A et U qui importe, mais plutôt les sucres (ribose/desoxyribose).

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Guillaume69

    Re : Reverse transcription et amorçage avec hexamères aléatoires ?

    D'ailleurs, ce n'est pas tant le "problème" de la complémentarité A et U qui importe, mais plutôt les sucres (ribose/desoxyribose).
    Je précise ce point. Face à un U, seul un A est complémentaire ; la RTase ne fait donc pas de "travail" de reconnaissance.

    La spécificité de cette enzyme vien du fait qu'elle reconnait sur l'ARN un ribonucléoside, et qu'elle peut catalyser (du fait de sa structure spatial ou, d'un point de vu énergétique, du fait des énergies d'activations qu'elle peut décomposer) la formation d'une liaison phosphodieter entre un dXTP et le fragement d'ADN en cours de synthèse.
    La complémentarité des bases n'est pas une spécificité enzymatique.

    Est-ce plus clair comme ça ?

  9. Publicité
  10. #7
    Koko76

    Re : Reverse transcription et amorçage avec hexamères aléatoires ?

    Parfait, je n'en demandais pas tant ^^.
    Merci ;D

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