Hybridation in situ et génération des sondes

[invite10adf645]

Bonjour à tous,

j'aurai bien besoin de conseils de quelqu'un connaissant l'hybridation in situ. En fait je cherche à montrer la colocalisation de 3 protéines sur des coupes de tissu nerveux. Malheureusement il n'existe un anticorps spécifique que pour une des 3 protéines, je dois donc passer à l'ISH pour les 2 autres.

J'hésite entre commander des oligos courts ou faire moi-même une sonde RNA.
- Avec des oligos courts j'élimine le problème de la synthèse car je peux les faire synthétiser à la demande. Par contre je devrai designer moi-même les séquences et j'ai peur de ne pas être bien spécifique
- Si je choisis la sonde RNA (qq centaines de bases), je peux m'appuyer sur la biblio qui m'offre un papier splendide avec les séquences utilisées. Par contre je vais devoir me lancer dans la synthèse moi-même.

Quel choix me conseillez-vous ?

Si je dois synthétiser moi même la sonde, quel serait le plus simple (en évitant si possible la transformation de bactéries car le labo n'est pas équipé) ?
J'ai vu qu'on pouvait amplifier le fragment cible de cDNA par PCR, puis le réamplifier en ajoutant simplement des sites PolA et PolB, permettant de transcrire le brin dans les deux sens. Ca a l'air trop simple. Quelqu'un peut me confirmer ?

Merci beaucoup à toi, âme charitable !

Fanou
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[Flyingbike]

tu peux aussi faire synthétiser une sonde RNA, non ?

[piwi]

Une sonde ARN pour in situ c'est 500 à 1000 pb. Ca risque de couter cher à synthétiser.

Il y a deux options dans la balance:
Commander des oligos et faire une RTPCR que l'on clone dans un plasmide portant les sites de transcription T7, T3, ou Sp6. Linéariser le plasmide et faire une transcription avec l'enzyme adéquate.
Commander les oligos avec les sites T7, T3, ou Sp6. Faire une PCR et ensuite une transcription sur le produit PCR.

Cordialement,
piwi

[invite10adf645]

J'ai trouvé des boites proposant des custom RNA, mais le problème c'est la taille, généralement ils ne peuvent pas dépasser 40b, voir 80 mais le prix s'envole.
Les séquences que j'ai dans la biblio sont beaucoup plus grandes (minimum 500b). Ils font même du full-lenght !

Donc le problème c'est que soit je dispose de séquences qui marchent mais que je dois synthétiser moi-même, soit je design des petits oligos à commander, en espérant que ce soit spécifique et efficace.

Mais s'il existe une boite capable de fournir de grosses sondes je suis preneur !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite10adf645]

C'est plutôt la deuxième solution qui m'intéresse piwi.

Tu penses que c'est envisageable de me lancer là dedans à 11 mois de la fin de thèse ? Ca parait simple mais avec la biologie moléculaire j'ai tendance à me méfier...

Concernant la PCR, ne doit-on pas la faire en deux étapes ?
Premièrement on amplifie la séquence cible, puis on réamplifie les produits de PCR avec les mêmes oligos, flanqués de sites de transcription non ?
Si on utilise directement les oligos avec les sites de transcription, on ne risque pas d'empêcher l'hybridation vu que seule la moitié de la séquence sera complémentaire ?
Il faudrait un dessin mais j'espère que c'est compréhensible comme ça !

en tout cas merci de ton aide

[piwi]

Non pas besoin de dessin
Tu peux procéder en une étape, ça ne gène pas. Tu designes tes oligos complémentaires 20 mer classiques et tu rajoutes au bouts tes sites de transcription.
11 mois pour faire une in situ c'est très jouable. Quelques jours pour recevoir les oligos commandés, un peu de mise au point pour la PCR (une ou deux journée), faire la sonde (1/2 journée). L' in situ dure trois-quatres jours. Si ça fonctionne du premier coup c'est vite plié. Si ça veut pas... Là, ça peut être long mais on ne peut pas prévoir.

Cordialement,
piwi

[invite10adf645]

Merci beaucoup, j'avais bien besoin d'un peu d'optimisme !

Je vais tenter le coup. Pour le prix de deux enzymes et d'un couple d'oligos on ne risque pas grand chose.

Dernière chose avant que je me lance à corps perdu dans l'ISH :
Aurais-tu des protocoles efficaces ou des conseils à me donner ? et as-tu un/des fournisseurs à me conseiller pour l'achat des polymerases & oligos ?

[inviteedae60bb]

http://www.imagenes-bio.de/

Cette entreprise vend des clones EST de pas mal de gènes. A essayer.

[invite10adf645]

J'ai un peu bûché sur la question ce week-end et j'ai fait 2 schémas que je voudrai vous soumettre (en pièces jointes).

Le premier "ISH T7", c'est juste histoire de vérifier que je ne me suis pas trompé d'orientation pour mes réactions. J'amplifie mes cDNA avec un primer couplé au promoter T7 et un primer simple.

Le deuxième "ISH T3-T7", c'est parce qu'on risque de me demander un contrôle avec une sonde "sens", pour vérifier qu'il n'y a pas de signal en ISH. Du coup je pensait faire la PCR avec une primer couplé à T3 et l'autre à T7. Par contre je devrai me retrouver avec la séquence complémentaire du promoter T3 (si je transcrit avec T7) en 3' de ma sonde ARN (voir le schéma).
Est-ce que ça risque de poser un problème pour l'ISH ? Vaut il mieux faire deux manips différentes plutôt qu'un template commun à transcrire dans un sens ou dans l'autre ?

J'ai une deuxième petite question. J'ai trouvé pas mal de protocoles où la PCR est faite en deux étapes. Après la première on isole la bande spécifique sur gel pour s'en servir de template pour la deuxième. Je comprends que ça puisse augmenter la spécificité, mais si la première PCR est propre, y'a-t-il vraiment besoin de ces deux étapes ?

Merci de votre aide !

Fanou