Hybridation in situ

[invite5796d8ec]

Bonjour,

je suis en thèse et je dois réaliser une ISH or je n'en ai jamais fait de ma vie. j'ai récupéré des protocoles mais je voudrais savoir comment faire le design des amorces pour mon gène avec T3 et T7 ?? HELPPPPPPPPP

merci beaucoup
-----

[invite9e1fd470]

Avec ton gène T3 ou T7 c'est quoi ce que tu veux dire ?

J'ai fais pendant 3 mois des ISH et je faisais une transcription in vitro, donc mes sondes étaient de l'ARN. Pourquoi as-tu besoin d'amorces ?

[invite5796d8ec]

je pense que je ne maitrise pas bien le sujet, aurais tu une revue, article à me conseiller?? la synthese de ribosonde c'est vraiment conceptuel pour moi.... merci pour ta réponse

[piwi]

Les amorces c'est pour designer la sonde que l'on va insérer dans un vecteur qu'il faudra ensuite linéariser par restriction selon l'orientation et transcrire (souvent avec la T3,la T7 ou la SP6 polymérase) pour obtenir de l'ARN.

Le design de sonde n'est pas évident. Il vaut mieux ne pas prendre trop gros (500-800/1000 pb). Faire attention aux zones d'homologie. Donc bien étudier la protéine pour voir les domaines spécifiques et taper dans la région d'ARN correspondante.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9e1fd470]

Piwi, ce n'est pas la sonde que l'on insert dans le vecteur mais l'ADNc codant pour la sonde (il faut utiliser les bons mots sinon on s'embrouille facilement). Pour ce qui est de la taille de la sonde je suis même d'avis d'en faire une d'un maximum de 600 pb, tu est très largement spécifique avec une sonde de cette taille.

As-tu un schéma de ta construction car je dois savoir comment tu as orienté ton ADNc et ou se trouve tes promoteurs pour les ARN polymérase. Car ta sonde doit être antisens, pour pouvoir par la suite s'hybrider de façon complémentaire avec l'ARNm du gène que tu recherche.

Sinon pour ce qui est d'article je n'en possède pas, mais j'ai mon rapport de BTS qui explique bien le principe ainsi que des schémas que j'avais fait si celà t'intéresse.

Cordialement

[piwi]

Abus de language après des années d'in situ. Désolé pour le jargon.

[inviteea98018d]

Bonsoir John Irwin ; personnellement ça m'intéresse!! pouvez-vous me le passer s.v.p??
merci d'avance

[invite5796d8ec]

John tes schémas m'interressent fortement!!
merci pour toutes ces reponses! j'y vois plus clair.