Hybridation in situ

[invite89902e9c]

Bonjour,
J'ai une question concernant l'hybridation in situ et je ne trouve pas de réponse. Voilà : dans mon protocole, je fais une préhybridation avec un tampon contenant de l'ADN de sperme de saumon, du formamide désionisé et du SSC 20X. Je sais que cette préhybridation permet de réduire le bruit de fond mais j'aimerai savoir comment ça fonctionne exactement, quel est le rôle de chaque produits utilisé ?
Alors si quelqu'un à la réponse (ce dont je ne doute pas un seul instant) je le remercie d'avance.
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[piwi]

La sonde peut s'hybrider de façon aspécifique sur l'ADN. Si l'on ne fait rien alors cette hybridation donne du bruit de fond.Le but du de l'ADN de saumon (on utilise celui ci parce que le saumon pond beaucoup d'oeuf, du coup on peut en avoir beaucoup rapidement) est de capter les hybridations aspécifiques. Ensuite, on rince et cet ADN fiche le camps avec le bruit de fond.

La formamide sert à dénaturer (en rompant les liaisons hydrogènes) la sonde de façon à ce qu'elle puisse s'hybrider facilement à sa cible.

Le SSC 20x est un tampon citrate qui va augmenter la force ionique et faciliter ainsi les hybridations.

Donc, la formaide et le SSC 20x (1x finale) servent a augmenter la stringence du milieu et favoriser l'hybridation.

Cordialement,
piwi

[invite89902e9c]

Je te remercie de ta réponse Piwi.

Donc si je comprend bien le principe, l'ADN de saumon se fixe sur l'ADN et l'ARN du tissu sur lequel je veux faire l'hybridation in situ, et quand je dépose la ribosonde spécique il y a une compétition entre l'ADN de saumon fixé et la sonde, diminuant ainsi le marquage aspécifique tandisque ma sonde se fixe sur l'ARN que l'on veut mettre en évidence ?

Encore merci
Shedûn

[piwi]

C'est juste que ta sonde peut se fixer sur des sites aspécifiques. Si le nombre de site aspécifique du à l'ADN de saumon est superieur au nombre de sites andogènes alors la probabilité qu'une hybridation aspécifique se fasse avec l'ADN de saumon est plus grande que celle qu'elle se fasse avec du matériel endogène. Donc tu déplace le bruit de fond vers l'ADN de saumon. Et comme tu vas éliminer cet ADN tu diminues le bruit de fond de ta préparation. L'interet de l'ADN de saumon est de diminuer le signal nucléaire de tes préparation (hybridation ADN/ARN). Ca reste très théorique et dans la pratique je ne le fais pas.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite89902e9c]

Super, merci! Ca répond tout à fait à ma question.