hybridation in situ vs rapporteur

[invitef1b4a1e8]

Bonjour,

Pour étudier la localisation de l'expression d'un gène (à l'échelle cellulaire, pas subcellulaire), quel est l'intérêt de l'hybridation in situ par rapport à l'utilisation d'un rapporteur sous contrôle du promoteur de ce gène? (ou l'intérêt de cette dernière technique par rapport à la 1ere?)

L'hybridation in situ détecte les ARNm alors que dans le cas du rapporteur, on visualise une protéine ou son produit, mais comme cette protéine n'est pas le produit du gène étudié, on ne peut rien en déduire sur une éventuelle régulation post-transcriptionnelle ou -traductionnelle, si?
Si l'ARNm était instable, le choix du rapporteur serait certes plus judicieux, mais cela ne semble pas être le cas dans l'article que j'étudie...

Est-ce que l'une des deux méthodes permet une localisation plus précise?

En gros, quel est l'intérêt d'avoir utilisé les deux approches, si ce n'est de renforcer les résultats? mais je suis surement passée a côté de quelque chose...

Merci d'avance pour vos éclaircissements

Véro
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[invite94612525]

Saulte Vero,

Pour étudier la localisation de l'expression d'un gène (à l'échelle cellulaire, pas subcellulaire), quel est l'intérêt de l'hybridation in situ par rapport à l'utilisation d'un rapporteur sous contrôle du promoteur de ce gène? (ou l'intérêt de cette dernière technique par rapport à la 1ere?)

Si la manip marche bien, l'hybridation in situ est plus rapide que le gene rapporteur, car il n'est pas nessaire de transformer l'organisme en question. Par contre, pour l'insitu, on doit tout recommencer si l'on veut changer une condition experimentale, alors qu'avec le gene rapporteur, on peut garder l'organisme transforme. Mais a mon avis, le principal avantage de l'in situ est que l'on detecte directement l'ARN present a un moment donne alors qu'avec le gene rapporteur, on s'eloigne un peu de la situation normale puisque l'on a du introduire une construction dans l'organisme (il y a eu des problemes, cf Taylor C.B. (1997) Promoter fusion analysis: an
insufficient measure of gene expression. Plant Cell
9, 355-365) .


L'hybridation in situ détecte les ARNm alors que dans le cas du rapporteur, on visualise une protéine ou son produit, mais comme cette protéine n'est pas le produit du gène étudié, on ne peut rien en déduire sur une éventuelle régulation post-transcriptionnelle ou -traductionnelle, si?

Ca depend comment est realisee la fusion, il est possible de faire une fusion traductionnelle du gene rapporteur avec la proteine d'interet afin de detecter la localisation de celle ci. Dans ce cas, il est recommande de transformer une telle construction dans un mutant pour le gene d'interet afin de voir si la proteine de fuision complemente le phenotype (un tres bon controle).

Mais tu as raison dans le cas d'une sipmle fusion promoteur-Gene rapporteur. Il est meme parfois pas evident que ca reflete l'expression normakl de l'ARNSm sdi d'autres elements que le promoteur entre en jeu (introns par ex)


Si l'ARNm était instable, le choix du rapporteur serait certes plus judicieux, mais cela ne semble pas être le cas dans l'article que j'étudie...

Est-ce que l'une des deux méthodes permet une localisation plus précise?
non, sauf dans le cas d'une fuison traductionnelle rapporteur-proteine d'interet



En gros, quel est l'intérêt d'avoir utilisé les deux approches, si ce n'est de renforcer les résultats? mais je suis surement passée a côté de quelque chose...
Non, c'est un tres bon argument pour faire les deux


Noun

[piwi]

j'ajoute que l'in situ peut se faire sur plusieurs mRNAs dans une baterie de manip'. Tu peux tester par exemple l'effet d'une mutation sur plusieurs gènes.
Pour les rapporteurs tu ne peux pas faire ca. Tu vas plus faire du phénotypage finalement.

[invited8287251]

Moi, je suis pour l'"in situ", des éléments cis régulateurs importants peuvent se trouver 20kb en amont ou , dans des introns, ou en aval du gène.
Ceci dit, c'est une pratique très fréquente , chez C. elegans, et jai jamais vraiment compris pourquoi, car l' "in situ" marche chez C. elegans.
Cette question tombe bien , car j'en avais une autre sur C. elegans, comment sont produites les délétions issues du consortium, j'faisais un séminaire interne au labo,( j'ai pas cherché la réponse, car une personne du labo a fait un post-doc sur ce vermisseau )
La réponse était , mutagénèse chimique (EMS), à haute dose, chose utilisée chez la mouche, pour faire des mutations ponctuelles et qui à haute dose provoque des tonnes de mutations.
Bin j'ai pas compris comment on pouvait faire une "mutagénèse clean" ( C.A. d., sans qu'il y ait plein d'autres mutations sur le chromososome). Ceci dit j'suis sur que ça marche car ils le font!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef1b4a1e8]

Merci à tous pour vos réponses!! (même si je ne suis pas sure d'avoir compris l'histoire du "phénotypage" de piwi...).

Pour 9herve :
je pensais que l'EMS était utilisé chez C.elegans à faible dose à la fois pour induire des mutations ponctuelles et des délétions. Seulement, le taux de délétion doit être très inférieur à celui des mutations ponctuelles (quelque chose comme 10% des mutations totales selon mes souvenirs...). Donc pas besoin d'utiliser des fortes doses, il "suffirait" de discriminer les délétions dans l'ensemble des mutants obtenus?
... à vérifier!

[invite9e6bc039]

Hello,

pour répondre au problème de déletion chez C.elegans, c'est bête comme chou.

On fait une grosse mutagénèse pas clean du tout et on génère une "banque" de vers que l'on garde en triplicat, de l'ordre de 20 vers par puits (plaque 96 voire plus...).
Le premier va directement à -80, le second est un back up, et sur le troisième on fait une prep' ADN.
La technique consiste à pooler toute une plaque et faire une PCR dessus, ainsi on détermine dans quelle plaque la déletion est présente. Après on desccend la résolution en faisiant de même pour chaque ligne et ainsi de suite on remonte à un puit.
Donc on sait dans quel puit se trouve notre déletion, après il suffit de décongeler le puit correspondant, séparer les 20 vers présents et faire une PCR sur chaque. Et vous déterminer quel ver UNIQUE possède la déletion


Pour "nettoyer" y'a pas de secret, faut back-crosser le plus possible. Mais avec elegans (oh le jeu de mot ) il est possible d'accélérer la manoeuvre: ex, vous croisez votre mutant avec le background sauvage, et vous prenez les mâles issus du croisement (donc heterozygote pour la déletion) que vous re-croisez directement avec le sauvage. Après 3 générations vous avez "nettoyé" 3/4 au lieu de 1/2 etc


Il y a d'autres techniques "ciblées" qui sont en train d'être mises en place... mais je peux pas encore en parler Après publication pas de problème



edit: pour augmenter la probabilité de générer des déletions, on peut utiliser une longueur d'onde précise d'UV (avec le microscope en utilisant le filtre à DAPI... )

[invited8287251]

Hello,

pour répondre au problème de déletion chez C.elegans, c'est bête comme chou.

On fait une grosse mutagénèse pas clean du tout et on génère une "banque" de vers que l'on garde en triplicat, de l'ordre de 20 vers par puits (plaque 96 voire plus...).
Le premier va directement à -80, le second est un back up, et sur le troisième on fait une prep' ADN.
La technique consiste à pooler toute une plaque et faire une PCR dessus, ainsi on détermine dans quelle plaque la déletion est présente. Après on desccend la résolution en faisiant de même pour chaque ligne et ainsi de suite on remonte à un puit.
Donc on sait dans quel puit se trouve notre déletion, après il suffit de décongeler le puit correspondant, séparer les 20 vers présents et faire une PCR sur chaque. Et vous déterminer quel ver UNIQUE possède la déletion


Pour "nettoyer" y'a pas de secret, faut back-crosser le plus possible. Mais avec elegans (oh le jeu de mot ) il est possible d'accélérer la manoeuvre: ex, vous croisez votre mutant avec le background sauvage, et vous prenez les mâles issus du croisement (donc heterozygote pour la déletion) que vous re-croisez directement avec le sauvage. Après 3 générations vous avez "nettoyé" 3/4 au lieu de 1/2 etc


Il y a d'autres techniques "ciblées" qui sont en train d'être mises en place... mais je peux pas encore en parler Après publication pas de problème



edit: pour augmenter la probabilité de générer des déletions, on peut utiliser une longueur d'onde précise d'UV (avec le microscope en utilisant le filtre à DAPI... )

Donc, c'est aux UVs, pas à l'EMS, je comprends mieux.
Nouvelles techniques de délétions? Avec des transposons et de la recombinaison?

[invite9e6bc039]

Nan, un truc nouveau

Qui te permet de générer une mutation ponctuelle dans un locus précis (tjs à base d'UV) et de remonter directement au ver unique qui posséde cette mutation...

Pour donner un indice, il existe une enzyme capable de reconnaître un mis-match et de le cliver... le reste n'est que stratégie de détection