Hybridation in situ

[invite6c5226a2]

Bonjour,

Je dois faire une hybridation in situ sur coupes; mais je n'ai aucune idée du protocole, de ce que je dois faire et où chercher.
Donc si vous êtes un pro de l'HIS, aidez-moi svp
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[piwi]

Salut.

Je peux te passer un protocole si tu en as besoin mais sais tu préparer une sonde ARN?
Sinon, faudra commencer par là

[invite6c5226a2]

Salut.

Je peux te passer un protocole si tu en as besoin mais sais tu préparer une sonde ARN?
Sinon, faudra commencer par là

En effet, il faut commencer par là ^^'
Merci ^^

[gorben]

Salut

Pourquoi preparer une sonde ARN pour de l'hybridation in situ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Courage, courage, courage.....

La première chose à faire est de trouver la séquence de tes ARNs cibles. A partir de là tu définis deux oligos pour avoir une séquence amplifiée de grosso modo 500-1000 pb.
Ensuite, tu prélèves un tissu où ta cible est fortement exprimée de façon très rapide et très propre (20-30 mins, outils nettoyés à l'alcool, autoclavés... tout au mieux). Tu les mets dans un eppendorf puis azote liquide.

Quand tu en as assez tu extrais les ARNs puis tu synthétises les ADNc. Avec les amroces que tu a definis au départ tu vas pouvoir amplifier tes ADNc d'interet. Donc un PCR à mettre au point. Courage!

Ceci fait tu inserts tes ADNc dans un plasmide (PSK) et tu clones. Tu fais des miniprep ect..., trouve celui qui contient ton insert d'interet et tu sous clones.
Ouf!! On y est.

Tu as maintenant ton plasmide bien propre que tu conserves au congel à -20. Tu peux attaquer!
Tout d'abord connaitre la concentration en plasmide.
Moi je fais 1 microlitre de plasmide dans 400 microlitres de flotte.
la concentration en microgramme par microlitre est donnée par la DO.
C=DOx400x50/1000

Tu vas linéariser ton plasmide
10 microgram de plasmide
1000U Ez de restriction (selon le plasmide et l'orientation de l'insert dans le plasmide.)
Tp Ez
flotte QSP
tu digères 1h à 37°C puis tu peux verifier que c'est bien coupé en faisant migrer un peu de ton mix sur un gel.

Ensuite moi je reprécipite l'ADN
Si V le volume de ton mix alors
V/2 NH4Ac
2.5 V EtOH froid (-20°C)
30 mins max au -80°C
centrifugation à froid 30 mins à 13 000 rpm
tu laves dans EtOH 70° puis tu recentrifuges un peu et tu vides puis laisse secher. Tu reprends dans 10 microlitres de TE.

Pour la transcription de la sonde il te faudra dans 20 microlitres final:
2 microgram d'ADNc linéarisé (donc 2 microlitres si tu suis)
2 microlitres d'un mix ATP, CTP, GTP 10 mM
1.2 microlitres UTP 10 mM
0.8 UTP-digoxigénine 10mM (c'est ton marqueur)
0.5 microlitres Rnasine 40U/microL)
0.5 DTT 0.5mM
4 microL Tp de transcription 5x
2 microL de ton Ez de RNA pol à choisir selon tes besoins.

2h à 37°C et tu fais migrer un petit aliquote pour voir la tronche du résultat.

Tu précipites le reste 2x dans 2.5 microL LiCl 4M + 75 microL EtOH 100% froid. (la seconde fois tu ajoute 22 microL H2O) et tu mets ca à chaque fois 1/2h à -80 sans oublier de centrifuger au moment des rincages.
Enfin tu laves à EtOH 70° tu centrifuges une dernière fois, tu vides, tu seches et tu reprends dans 100 ou 200 microL de tampon d'hybridation en fonction du gel que tu auras fais un peu plus tôt.

On parle de la suite quand tu auras deja ca?

[piwi]

Salut

Pourquoi preparer une sonde ARN pour de l'hybridation in situ?

Ben parce que le principe c'est d'hybrider des ARNs..... la sonde est une sonde ARN antisens à l'ARN natif présent sur les coupes et que tu cherches à réveler.

[invite6c5226a2]

On parle de la suite quand tu auras deja ca?

Je vais imprimer tout ça et y réfléchir pour bien tout comprendre! et après on parlera de la suite lol

Merci bcp

[gorben]

Ben parce que le principe c'est d'hybrider des ARNs..... la sonde est une sonde ARN antisens à l'ARN natif présent sur les coupes et que tu cherches à réveler.

hmm... je dois confondre avec autre chose alors...

désolé

a+