proteine recombinante d'interet médical

[invite4153a4de]

bonjour

Je suis en licence et en TD on nous a donné un sujet sur lequel j'espere vous pourrez me donner votre avis et m apporter éventuellement votre aide :

il faut produire une proteine à usage thérapeutique chez l'homme et cette protéine présente quelques caractéristiques elle aura 3 ponts S-S; MM de 100 Kda; glycosylation à 15% et elle sera injecté en intra veineuse et le prof nous demande comment peut on faire pour la faire produire et exprimer. Voila j espere que vous pourrez m'aider.merci
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[Flyingbike]

tu as deja une idée?

[invite4153a4de]

ben j'ai pensé aux plantes transgéniques pour introduire le gene exprimant cette protéine dans un compartiment de la plante où naturellement elle n'est pas produite donc voila pour le système d'expression mais par contre je ne vois pas en quoi il nous donne les caractéristiques de cette protéine.

[fabien.che]

Si c'est pour un usage thérapeutique chez l'homme, alors oublie les plantes !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite4153a4de]

ah oui je vois pour la
différence entre les processus de glycosylation
des protéines existant chez l'homme
et les plantes. Donc il faudra utiliser des bactéries comme hôtes mais y a t-il quelqu un qui comprend pour quoi on nous donne les caractéristiques de cette protéine qui sera complétement synthétisée et en quoi ca va aider pour le système d'expression?merci

[fabien.che]

Donc il faudra utiliser des bactéries comme hôtes

Aïe ! Non plus pour les bactéries. Il te faut un système eucaryote !

Edit : Ceci peut t'aider : http://www.inra.fr/gdr-biopolymeres/...combinante.pdf

[invite4153a4de]

donc il faudrait compter sur des animaux transgéniques en faisant de la micro-injection dans les pronuclei ou dans le cytoplasme de l'embryon, des vecteurs rétroviraux insérant le gene codant pour cette protéine.

Pourtant avec E Coli c'est très courant??

as tu une idée pour le reste des infos (Masse moléculaire, ponts disulfures ...)?

[fabien.che]

donc il faudrait compter sur des animaux transgéniques en faisant de la micro-injection dans les pronuclei ou dans le cytoplasme de l'embryon, des vecteurs rétroviraux insérant le gene codant pour cette protéine.

Il y a plus simple, tu peux déjà commencer par regarder les lignées CHO, Vero, ...

Pourtant avec E Coli c'est très courant??

Oui, pour les manip in vitro, voire in vivo chez la souris par exemple, mais pour l'homme, tu crois vraiment ?

as tu une idée pour le reste des infos (Masse moléculaire, ponts disulfures ...)?

Tu parlais des vecteurs, la taille du transgène par exemple, est un élément décisif dans le choix du vecteur.

[invite4153a4de]

franchement je suis largué pour le choix du vecteur...
donc je pense:
tout d'abord, il faut d'isoler le gène d'intérêt (mais dans ce cas faudrait le synthétiser non?), codant pour la protéine recherchée.
le gène d'intérêt est alors inséré dans un vecteur (lequel je ne sais pas encore) qui doit être capable de se répliquer et de répliquer le gène étranger qui lui est rattaché ;
ensuite introduire la molécule d'ADN (vecteur + gène d'intérêt) dans une cellule hôte , qui exécute les instructions qui lui sont fournies par le gène d'intérêt, et réalise les modifications post-traductionnelles (les 3 ponts disulfures et la glycocylation à 15 %) dans l'objectif de fabriquer la protéine recherchée. L'hôte sera donc par exemple des cellules CHO.
ensuite culture de masse en bioréacteur afin de produire les volumes de protéine nécessaires ;
la protéine sera enfin récupérée puis purifiée (séparation, extraction, purification d'ou l interet de connaitre sa masse moleculaire face à des marqueurs de poids)
il s'ensuit des essais biochimiques et immunologiques pour contrôler la qualité, la pureté et l'activité de la protéine produite

qu est ce que vous en pensez?

[fabien.che]

Ton raisonnement est plutôt pas mal.

Il faut aussi penser à conserver un environnement oxydant pour maintenir les ponts disulfures.

[invite4153a4de]

ok et à ton avis quel vecteur choisir?

[fabien.che]

Tu as parlé de vecteurs rétroviraux, mais sache qu'il existe d'autres types de vecteurs.

- d'autres vecteurs viraux (AAV, Adénovirus, ...)
- des vecteurs non viraux (lipides cationiques, ...)

Concernant ta problématique, il se trouve effectivement que les rétrovirus semblent être le meilleur choix.

Pourquoi ? Ils sont intégratifs, donc on a une expression à long terme, et comme tu es sur un système cellulaire, les dérives de l'intégration (cancérisation) ne sont qu'une menace financière (ça peut écrouler ton système mais pas de danger direct pour le traitement chez l'homme).

Et puis, les vecteurs non viraux sont encore très (trop) faiblement efficaces !

[mantOs]

Produire en cellule humaine n'est pas la panacée.

L'insuline humaine utilisée pour les patients a été/est produite chez Ecoli, chez S.cerevisiae et maintenant si je ne m'abuse chez la plante.

Donc il existe pas mal de systèmes, de production de masse on va dire, de protéines à visée thérapeutique (ou pas) humaine.

E coli pour la bactérie
S.cerevisiae pour la levure
SF9/Baculovirus pour la cellule eucaryote non-levure.

[fabien.che]

Pour des protéines glycosylées, vraiment ?

[AstroBax]

Les levures possèdent un système de glycolysation complexe, même s'il est différent de celui des mammifères; des recherches sont actuellement en cours pour inhiber la glycolysation propres aux protéines de levures et la remplacer par la glycolysation des mammifères, ce qui permettrait d'utiliser les levures à plus grande échelle.

Et oui, l'insuline à bien été produite dans E.Coli, le principal problème est la formation des ponts disulfures (6 Cys en tout). Les deux chaînes de l'insuline sont produites séparément, et dans les bonnes conditions, les ponts SS se forment aux bons endroit et mène à la formation d'une insuline active.
Alors même si ça marche pour E.Coli, c'est une méthode plutot compliquée...