Concentré une protéine recombinante
SAlut les amis !!
J' ai fait plusieures purifs d'une protéine recombinante de 7 kDa. Elle se trouve dans un tampon Imidazole 500 mM. Je voudrai maintenant la concentré et la passer dans un tampon 50 mM phosphate. Question : est il possible de faire d'une pierre, deux coups ? et Quels sont le méthodes éfficaces pour concentré et /ou changer le tampon d'une protéine de 7 kDa ?
Merci d'avance pour votre aide les amis !
il y a bien la précipitation, mais je crois savoir que les protéines précipitées sont très difficiles a resuspendre.
Qu'entend tu par précipitation ? (tampon de précipitation ?)...
il y a plusieurs méthodes pour précipiter les protéines : http://wolfson.huji.ac.il/purificati...ipitation.html
Bonjour,
Je vais peut-être dire une bêtise mais on sait jamais. Ca pourrait pas marcher en faisant une sorte de dialyse avec un boudin de dialyse?
ah oui c'est pas une mauvaise idée ! je sais pas si c'est possible mais pourquoi pas...
Il me semble que l'on avait fait ça en TP pr concentrer une protéine recombinante (facteur de croissance) mais je ne me rappelle plus des tampons et du protocole!
j'avais pensé à la dialyse, mais existe t-il des boudins avec un seuil en dessous de 7000 Da . ? car je dois pouvoir garder ma prot dans le boudins...
je vais regarder les méthodes de précipitations
MERCI....
Que je sache, la dialyse ne permet pas de concentrer mais plutôt d'enrichir un échantillon en macromolécules de taille supérieure à la porosité de la membrane...L'enrichissement doit plutôt être vu comme une augmentation du rapport [macromolécule d'intérêt]/[solutés] alors que [macromolécules d'intérêt] ne varie pas. Il n'y a donc pas concentration de la protéine avec cette méthode mais plutôt augmentation de la pureté.
Pour concentrer les protéines, il existe des filtres de porosité donnée (je ne sais pas s'ils descendent en-dessous de 10 kDa), qui permettent d'éliminer la quantité voulue de tampon tout en retenant la protéine. On a donc bien une augmentation de la concentration de la protéine. Cela peut aussi permettre de passer la protéine d'un tampon à un autre, il suffit d'éliminer une forte quantité de tampon (ne jamais faire arriver la protéine à sec) et d'ajouter à la quantité restante le tampon voulu. Avec cette méthode, la protéine reste sous forme native et soluble, contrairement aux méthodes de précipitations.
Greg
Je m'y connais peu, mais c'est les centricons les filtres non ?
Oui tout à fait! Désolé je n'avais pas précisé le terme adéquat dans mon message. Il y a aussi une autre forme de filtre de même type, ce sont des membranes qui se placent au fond d'un dispositif similaire à un buchner (grosso modo) où on dépose l'échantillon à concentrer puis on applique une forte pression pour faire passer le liquide. Cependant je doute que ce dispositif puisse descendre aussi bas en porosité que les centricons. Les pistes expérimentales sont toutefois lancées.
Greg
Si si, il y a des centricons avec un cut-off à 3 kDa. çà devrait suffire.Envoyé par LXR
Bonjour,
Pour reconcentrer ta protéine et changer ton tampon tu peux comme il a été dit utiliser l'ultrafiltration si tu as dans ton labo le matériel nécessaire (Microcon, Centricon, Amicon, Vivaspin ...).
Sinon, tu pourrais aussi fixer ta prot sur une colonne (échangeuse d'ions par exemple). Comme ça tu enlèves ton imidazole pendant le dépôt et le lavage, et tu concentres ta protéine pendant l'élution. Ca peut parfois être plus rapide que l'ultrafiltration.
microcon YM3 de chez millipore. Cut off 3Kd.
Ce qui est chiant c'est que le volume du contenant est petit (un truc comme 500µl). Mais on peut en faire tourner plusieurs en même temps (ça marche par centrifugation).
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Merci les amis !
je vais essayer le microcon YM3, ça devrai le faire. enfin j'espere
encore merci pour votre aide à tous.
