Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

[invitef1754d56]

Bonjour,

J'ai besoin d'aide pour une question dans un exercice portant sur la construction d'un vecteur d'expression pour une proteine recombinante.

Je vous explique le probleme et où j'ai un probleme dans la compréhension du protocole.

En fait, apres quelques questions, on cherche a comprendre le role de la Stathmine (enfin c'est ce que j'en ai deduit), une petite proteine exprimée dans le cytoplasme de la plupart des cellules eucaryotes.

Pour comprendre le role de cette proteine, on décide de produire par des cellules de souris une Stathmine recombinante fusionnée a la GFP (Green Fluorescent Protein) ce qui va je pense nous permettre de detecter la zone d'intervention de la proteine dans la cellule et donc son role.

On veut donc fabriquer cette proteine de fusion qui est composé de deux domaines correspondant chacun a l'une des deux proteines d'interet et reliés entre eux par une liaison peptidique. Si elle se replie bien alors la proteine exprimera les deux propriétés (cool ).

On arrive au passage qui me pose probleme.

Pour produire cette proteine de fusion dans les cellules de souris, il faut donc assembler un ADN recombinant puis de l'insérer dans un plasmide (ou "vecteur") d'expression permettant la transcription puis la traduction dans les cellules. Au préalable, afin de disposer de suffisamment de vecteur pour les cellules de souris, il est necessaire d'amplifier le vecteur dans le collibacille.

On me demande de présenter les caractéristique generales de ce type de vecteur pour permettre son amplification dans le colibacille puis l'expression de notre proteine recombinante dans les cellules de souris.

Alors voila ce que j'ai répondu mais je ne suis pas sur de moi et il manque peut etre des choses. Merci de m'éclairer :

- Il faut une origine de replication afin d'amplifier le vecteur dans le collibacille.
- Il faut un promoteur eucaryote permettant la fixation de l'ARN polymerase afin de transcrire notre gene d'interet eucaryote
-Il faut un terminateur eucaryote
- Et il faut au moins 2 sites de restrictions situés entre un promoteur et un terminateur permettant ainsi d'inserer l'ADN recombinant.

Manque t-il des choses ?

Ensuite j'ai une question, vu qu'on est dans un environnement eucaryote (pas polycistronique donc), comment faire pour assembler nos séquences codant pour la Stathmine d'une part et la GFP d'autre part sans que le codon STOP de la Stathmine arrete la traduction avant la synthese de la GFP ?

Merci d'avance pour votre aide.
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[Flyingbike]

Ton raisonnement paraît bon. Il manque cependant une petite chose : lorsque tu vas insérer ton vecteur dans tes bactéries pour le produire, il te faut un moyen de déterminer quelles sont les colonies qui expriment ta construction afin de les sélectionner. Tu vois de quoi je parle ?

Pour ta dernière question, il faut bien sur faire sauter le stop de la stathmine. Il y a plusieurs options : soit tu as un site de restriction bien placé, soit tu places la GFP après et tu modifie le codon stop en mutagénèse dirigée. Truc capital : les ADN codants pour ces deux protéines doivent être insérées dans le vecteur EN PHASE !

[invitef1754d56]

Il faudrait que je lie une protection a un antibiotique sur mon ADN recombinant pour que seules les colonies ayant incorporer l'ADN demeurent ?

Je ne connais pas la mutagènése dirigée, quel est le principe ?

Merci d'avoir souligner le probleme de phase, c'est un truc qu'on peut oublier.

J'avais une question aussi, je n'ai pas besoin de site de fixation de ribosome pour mes genes eucaryote vu que le ribosome "s'attache" grace aux queues de polyA et la coiffe en 5' ?

Pour revenir sur la synthese de mon ADN recombinant, on peut cliver aussi precisement que ça (enlever pile un codon stop).

Apparamment il y a deux moyens de faire cet ADN recombinant. Je suppose que c'est soit on fait Stathmine-GFP, soit l'inverse. Mais est ce qu'on obtient la meme proteine selon la façon d'assembler ses séquences ?

Merci d'avoir repondu en tout cas.

[Flyingbike]

Il faudrait que je lie une protection a un antibiotique sur mon ADN recombinant pour que seules les colonies ayant incorporer l'ADN demeurent ?

Oui, il existe une multitude de vecteurs contenant un gène de résistance à un antibiotique : ampliciline, kanamycine, etc... Ca permet de ne laisser pousser que les clones qui ont incorporé ta construction.

Je ne connais pas la mutagènése dirigée, quel est le principe ?

Il existe des kits permettant de modifier des bases spécifiquement en PCR, ca te permet de transformer par exemple un codon stop en autre chose.

J'avais une question aussi, je n'ai pas besoin de site de fixation de ribosome pour mes genes eucaryote vu que le ribosome "s'attache" grace aux queues de polyA et la coiffe en 5' ?

je n'y ai jamais réfléchi mais en effet les vecteurs de clonage contiennent la plupart du temps une séquence signal de polyadénylation.

Pour revenir sur la synthese de mon ADN recombinant, on peut cliver aussi precisement que ça (enlever pile un codon stop).

Tout a fait, si tu as une carte de restriction tu peux couper a la base pres. Il faut juste avoir un site bien placé. Comme ça tu peux supprimer la fin de ton ADNc et le rabouter a ton autre gène, sous réserve de sites de restrictions bien placés sur l'un et l'autre des fragments et qui permettent un assemblage en phase.


Apparamment il y a deux moyens de faire cet ADN recombinant. Je suppose que c'est soit on fait Stathmine-GFP, soit l'inverse. Mais est ce qu'on obtient la meme proteine selon la façon d'assembler ses séquences ?

Ca dépend. Vu que tu fais une protéine de fusion, tu ne peux exclure que le domaine GFP ne gêne la protéine d'intérêt (par encombrement par exemple). Dans ce cas tu peux essayer les deux types de construction, voire insérer un "linker" entre les deux domaines afin de les espacer un peu. Tout dépend de "l'architecture" de ta protéine d'intérêt.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef1754d56]

Un autre probleme se pose également.

Vu que j'ai peu de chance d'avoir un site de restriction juste apres mon promoteur et juste avant mon terminateur, cela signifie que l'ARN polymerase va me polymeriser un ARNm qui contient des codons supplémentaires par rapport à l'ARNm issues de la transcription de l'ADNc uniquement.

Alors que se passe t-il si il trouve un codon AUG avant le codon AUG voulu, j'aurai donc ma proteine qui contiendra des acide aminées supplémentaires... Ca ne va pas gener les propriétés de cette derniere ?

Et aussi, pour revenir sur la fixation du ribosome. Vu que j'incorpore mon plasmide dans la cellule eucaryote, ce dernier sera bien transcrit et il y aura ajout de la coiffe et de la queue de polyA permettant la fixation du ribosome pour la traduction ?

Encore merci de m'aider.

[Flyingbike]

Vu que j'ai peu de chance d'avoir un site de restriction juste apres mon promoteur et juste avant mon terminateur, cela signifie que l'ARN polymerase va me polymeriser un ARNm qui contient des codons supplémentaires par rapport à l'ARNm issues de la transcription de l'ADNc uniquement.


Je ne sais pas quel vecteur tu veux utiliser, mais il existe des centaines de vecteurs commerciaux qui comportent tout ce qu'il faut, dont un MCS ("multi cloning site") entre le promoteur et le terminateur. Ce site contient une grande quantité de sites de restriction et permet d'insérer facilement ce que tu veux. (voir image)


Ici tu peux voir entre le promoteur et le terminateur ce MCS qui contient plein de sites de restriction. Il y a aussi l'origine de réplication (ColE1), un gène de résistance à la néomycine (neoR).

Normalement il n'y a pas de condon start apreès le promoteur, vu que ce genre de vecteur est pensé pour y insérer un codant. DOnc ta protéine commencera à ton AUG.

Et aussi, pour revenir sur la fixation du ribosome. Vu que j'incorpore mon plasmide dans la cellule eucaryote, ce dernier sera bien transcrit et il y aura ajout de la coiffe et de la queue de polyA permettant la fixation du ribosome pour la traduction ?

Si ton vecteur est prévu pour l'expression en cellules eucaryotes, tout devrait aller bien.

[invitef1754d56]

Merci beaucoup !

Je voulais juste revenir sur 2 point. (Apres j'arrete d'embeter le monde ).

->Concernant le gene resistant a un antibiotique, il ne peut etre au depart sur le vecteur comme tu semblais le suggérer, non ?

Oui, il existe une multitude de vecteurs contenant un gène de résistance à un antibiotique

Car dans ce cas que j'ai incorporé ou non mon ADN, le plasmide restera insensible a l'antibiotique et je pourrais pas faire de distinction, non ?

Il ne faut pas que ce gene soit amener en meme temps que l'ADNc a implanter ?

-> Enfin concernant la façon de faire l'ADN recombinant (Stathmine-GFP, ou alors l'inverse). Le seul probleme qui pourrait intervenir c'est dans l'ordre de repliement de la proteine (qui se fait au cours de la traduction pour les acide aminés deja polymerisés) qui fait que j'obtiens pas la meme proteine selon le sens d'appariemment de mes deux genes d'interet dans l'ADN recombinant, non ?

[Flyingbike]

Car dans ce cas que j'ai incorporé ou non mon ADN, le plasmide restera insensible a l'antibiotique et je pourrais pas faire de distinction, non ?

Il ne faut pas que ce gene soit amener en meme temps que l'ADNc a implanter ?

en fait, pour incorporer ton insert contenant ta construction, tu dois linéariser le plasmide vecteur qui est à la base circulaire. Le plasmide linéarisé ne s'exprime pas.
Tu reviens à la forme circulaire au moment où tu insères ta construction avec une DNA ligase. A ce moment il y a deux solutions :

-soit ton vecteur est linéarisé avec 2 enzymes produisant des extremités différentes et non compatibles, les mêmes extrêmités que tu retrouves sur ton insert, et dans ce cas la construction ne peut redevenir circulaire qu'en incorporant l'insert

-soit ton vecteur est linéarisé avec une enzyme produisant des extrêmités "cohésives", ou bien des extrêmités franches. Dans ce cas tu traites le vecteur avec une phosphatase qui supprime les groupes phosphates aux extrêmités : ton vecteur ne peut pas se linéariser seul non plus.

Dans les deux cas, lorsque tu procèdes a la ligation de l'insert dans le vecteur et que tu fais exprimer cela dans la bactérie, tu fais une ligation contrôle contenant uniquement le vecteur linéarisé.

Tout ça fait que dans la culture contrôle (sans insert), tu devrais avoir moins de colonies que dans la culture ou tu as inséré le vecteur et l'insert puisque le vecteur est en principe incapable de se linéariser.
Le rapport nombre de colonies dans la boite témoin/nb de colonies sur la boite insert_vecteur donne une bonne indication de la réussite de la ligation et de l'incorporation de ta construction dans le vecteur. Il y a en général quand même des colonies dans la boite controle, prinicpalement parce que il subsiste quelques exemplaires circulaires de ton vecteur.

En conclusion, il n'y a pas besoin d'insérer le gene de résistance en même temps que ton gene d'intéret. Les vecteurs commerciaux ont tous un gene procurant une résistance antibiotique.

[invitef1754d56]

Un grand merci pour le temps que tu m'as consacré ! Tres interessant .

@ la prochaine.

[Flyingbike]

si tu as d'autres questions n'hésite pas !