Bonsoir,
Je ne comprend pas bien l'intérêt du système de clonage Gateway...
Pourquoi passer par 2 étapes de recombinaisons BP -> LR puis LR -> BP au lieu d'une ?
S'agit-il juste d'une question pratique? (pas besoin d'utilisation d'enzymes de restriction)
Merci d'avance pour vos réponses
Bonjour,
- un premier intérêt est celui que tu dis : tu n'utilises pas d'enzymes, pas besoin de choisir 2 enzymes différentes, de déphosphoryler le plasmide, phosphoryler les primers...ect... une simple PCR suffit pour l'obtention de ton gène avec les séquences nécessaires à l'introduction dans le plasmide
-les passages du gène d'intérêt dans le premier vecteur et le passage du premier vecteur au second, ne nécessitent pas d'amplification PCR avec la Taq... donc pas d'incorporation d'erreur de nucléotide par cette enzyme
-lors de la transformation, tes bactéries qui vont pousser sur pétri ont beacoup plus de chance de posséder ton gène d'intérêt car tes plasmides n'ayant pas recombinés possèdent un gène suicide...
-gain de temps comparé à la digestion enzymatique
Pour l'intérêt de tes 2 plasmides : générallement, ton second vecteur est un vecteur d'expression et non le premier vecteur...le premier vecteur te permet par exemple de séquencer le gène introduit...même si par précaution certains séquencent aussi après insertion dans le second vecteur (comme dit avant, les deux séquences sont censées être identique car pas de polymérase intervenant, il y a uniquement une recombinaison...)
Merci beaucoup ! c'est plus clair !Envoyé par ptiteaurelie
Cependant il y a encore un petit détail qui m'échappe...quand tu dis qu'il n'y a "pas d'amplification PCR" .. à quel moment on en aurait besoin puisque notre gène d'intérêt est déjà amplifié?
Bonne soirée !
oups désolé je comprends pas pourquoi j'ai écrit ça...Merci beaucoup ! c'est plus clair !
Cependant il y a encore un petit détail qui m'échappe...quand tu dis qu'il n'y a "pas d'amplification PCR" .. à quel moment on en aurait besoin puisque notre gène d'intérêt est déjà amplifié?
Bonne soirée !
ça revient au même qu'avec les enzymes pour l'insertion dans ton second vecteur sauf que là encore, tu n'a pas besoin de rédigérer ton fragment à partir de ton premier plasmide pour le mettre dans un plasmide d'expression. Ici, avec le système gateway, ton plasmide d'entré va directement servir à la recombinaison avec ton second plasmide.
