Bonjour,
J'ai un problème depuis quelques mois avec des cellules HEK293 EBNA.
J'ai transfecté les cellules avec mes constructions (à partir de miniprep), jusque là tout allais bien.
J'ai réussi à faire des testes d'expression de mes protéines qui ce sont tous avérés bon.
Mais lorsque j'ai voulu les passer en sur-production dans un plus grand volume et maintenant lorsque je veux re-décongeler une ampoule de mon stock j'ai un énorme problème :
La décongélation se passe bien, les cellules arrivent à adhérer, elles se développent bien sans pression de sélection, mais lorsque je rajoute celle-ci quelque chose d'étrange se passe :
Les cellules commencent à se décoller, elles perdent leur forme (leur contour devient strillé), en plus de cela, de nombreux débris sont présents dans le milieu ainsi que beaucoup de granules de stress dans les cellules…
Je n’ai toujours pas identifié les causes de ce problème mais j’en ai éliminé certaines :
Mis hors de cause :
DMEM, SVF, gentamycine car les cellules prolifèrent bien dans le milieu sans pression de sélection.
PBS : ne pose pas de problème.
Contaminations par bactéries ou levures impossible, car ce genre de contaminations de laisse aucun doute à cause de leurs rapidités.
Contaminations par micoplasmes, n’explique pas la présence d’autant de débris dans le milieu.
J'ai remarqué que cela intervenait après l'ajout de la pression de sélection. Donc la puromycine peut être en cause ou alors les cellules elles même, je me demande si elles n'ont pas subi un trop grand nombre de passages surement + de 60 des cellules non transfectées.
Si quelqu'un peut m'aider...
Je ne peux malheureusement pas prendre de photos de mes cellules mais si quelqu'un à des exemples de photos de contaminations, qu'il me fasse signe.
Merci d'avance.
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