[histologie] Problème de microscopie...

[kinette]

Bonjour,
J'ai une collègue qui a un problème délicat: elle aimerait étudier la spermatogénèse de tout petits insectes (des parasitoïdes, un peu plus petits qu'une drosophile: les testicules font de l'ordre de 500micromètres maximum).
Son problème est de pouvoir faire des coupes des testicules pour les observer en microscopie. Malheureusement l'organe est plutôt fragile et elle a tenté une préinclusion à la gélose avant une inclusion en paraffine mais ça n'a pas donné grand chose d'exploitable.
Si parmi vous certains maîtrisent les techniques de préparation histologiques (de tissus fragiles et petits) elle serait preneuse de conseils (ou si vous connaissez quelqu'un qui pourrait la conseiller).
De même, si certains d'entre vous connaissent bien la spermatogénèse des invertébrés (ou quelqu'un qui connaît bien ), l'échange pourrait être intéressant.

Merci d'avance!
K.
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[invite191f8f85]

Hello Kinette,

Elle peut essayer par exemple ce protocol qui preservera mieux son echantillon :

- fixation sur la nuit à 4°C avec du 4% paraformaldehyde (W/V) / PBS (ou formol)
- puis deshydratation à l'ethanol (classique 50-75-100%)
- puis un bain de toluene (ou xylene)
- puis inclusion paraffine..etc

Le top du top, quand on veut avoir une histo super preservée, c'est les inclusions aux résines epoxy (Epon ou Spurr) à la place de la paraffin. Ces résines permettent en plus de couper plus fins que 3µm !

En esperant que ca t'aidera....concernant la spermatogenese des mouches...j'y connais rien désolé !
A+

[invitef87b7d1f]

Salutations,
Je ne dis peut-être pas une connerie, mais peut-être en cryo...
@+

[invite191f8f85]

le cryostat, c'est rapide , pratique....mais pour une histo au top, l'ideal c'est l'inclusion.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite1e787f14]

alli a donné les bonnes pistes. Ne surtout pas passer par la cryo (sauf si tu as accès aux techniques de congélations ultrarapides, mais après c'est pénible à traiter...)

- pour de l'histo fine, passer en résine époxy plutôt qu'en paraffine. C'est pas plus compliqué à faire, et cela se coupe plus fin (puisque c'est plus dur...). Une résine fluide, type Spurr, te donne en général de bon résultats ; le bon vieil epon marche très bien aussi.
- ce qu'il faut aussi travailler, c'est les conditions de fixation.

+ Dans quelles conditions est ta collègue, et que veut-elle faire de ses échantillons par la suite ? Si c'est juste pour de la morpho, une bonne fixation glutaraldéhyde donnera à priori des résultats encore meilleurs que le formaldéhyde !

+ Il faut voir aussi si le fait de modifier l'osmolarité du fixateur ne peut pas améliorer les choses. Comme point de départ, il y a une bonne page pour cela ici. Traditionnellement, c'est fait avec du sucrose. J'avoue que j'ai tendance à fixer les tissus dans un milieu salin utilisé pour leur culture (PBS pour les tissus mammaliens) ; il faudrait voir ce que donne un ringer insecte, par exemple...

N'hesites pas à me contacter si tu veux des détails.

[invite191f8f85]

la réponse de yannB, m'a fait pensé au tampon cacodylate qui donne d'excelent résultat pour la fixation et la préservation des structures (meilleurs que le Tp PBS ou TBS):

!!!!cacodylate est un poision mortel contenant un derivé de l'arsenic!!! donc faire gaffe en le manipulant, de même que les fixateurs !!!

Preparer
0,1M cacodylate de Na+ (soit 2% w/v dans H2Od) = solution A
0,1 N HCl = solution B

Pour un tampon cacodylate pH 7,4 :
Mélanger 100ml de A à 5,4 ml de B et completer à 200ml avec H2Od.
Ajouter (à partir de solution mere 1000X) du CaCl2 et du MgCl2 pour avoir au final : 1mM et 0,5mM respectivement

Ce tampon servira à dissoudre le fixateur. Effectivement YannB, a raison le glutaraldehyde (0,25-1% v:v) est un excellent fixateur, mais attention il presente une tres forte autofluorescence vert-jaune. Donc à utiliser que pour faire de la microscopie à lumiere blanche.

A+

[invite191f8f85]

re-bonjour kinette,

en me baladant sur futura-sciences, je suis tombé par hazard sur la rubrique "carte blanche à" de Jean-Pierre Louvet. Et qu'ai-je découvert en lisant sa page....qu'il est specialiste en insecte mais surtout que c'est un pro de la preparation de tissus d'insecte pour leur etude en microscopie ! je pense que tu devrais lui exposer ton probleme, si lui n'a pas de protocol pour toi....alors personne ne pourra t'aider.

http://www.futura-sciences.com/compr...rre_louvet.php

A+