Bonjour,
En stage j'ai fait de la qPCR, et j'ai pu remarquer que j'avais une courbe de MELT très moche. On m'a expliqué que cela signifiait que j'avais une amplification non spécifique. Est ce que quelqu'un pourrait m'expliquer comment elle est réalisée?
Merci
la courbe ou l'amplification non spé ?
Désolée je n'ai pas été claire, je parlais de la courbe.. Quels paramètres permettent de la tracer?
Bonjour,
http://forums.futura-sciences.com/bi...controles.html
La courbe de fusion représente la décroissance de fluorescence de l'agent intercalant donc la quantité d'ADN double brin en fonction de la température que l'on fait augmenter (l'ADN double brin se dénature de plus en plus).
ici figure 3 : http://www.fabinet.up.ac.za/main/lightcycler
en haut, c'est la courbe de fusion native, elle représente la fluorescence en fonction de la t°. Elle est obtenue à la fin de l'amplification :
-la machine redescend a environ 60°
-elle augmente la température régulièrement tout en mesurant la fluorescence
ensuite en calculant la dérivée (-dF/dT), tu obtiens des "pics de fusion" ou chaque pic correspond à la température de fusion d'une population d'amplicons présents à la fin de ta PCR.
Merci beaucoup à vous deux je comprends mieux pourquoi ma tutrice m'as dit que la courbe de fusion était très mauvaise j'avais plein de pic de fusion.
Cela signifie que tu as aussi amplifié du non spécifique.
Il me semble que rarement il est possible d'avoir deux Tm à partir d'un produit spécifique amplifié mais en tout cas pas plus.
