interpretation de l'immunoprécipitation suivie de western blot

[invite9b44c3d1]

bonsoir, je voudrais savoir quelle conclusion faut-il tirer de l'expérience qui suit:
sur des extraits protéiques, on fait d'abord une immunoprécipitation avec des anti corps antiA (A = récepteur membranaire quelconque), ensuite on fait un western blot anti P Tyr (=anti tyrosine phosphorylée)

j'ai un doute là: lorsqu'on voit une tache sur le western blot, on en déduit que les tyrosines sont phosphorylées, mais est ce qu'on peut dire que le récepteur membranaire est phosphorylé?
parce que je me dis que peut-etre c'est autre chose qui est attaché au récepteur qui possèdent des tyrosines phosphorylées et non le récepteur lui meme, donc si on concluait que le récepteur est phosphorylé ne serait ce pas de l'extrapolation?

merci d'avance
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[TanguyE]

Bonjour,

Tout dépend du poids moléculaire de la "tâche" de ton western. Si tu as plus de données sur ton récepteur, tu peux comparer le PM de la tâche et celui du récepteur.
S'ils sont similaires tu peux avancer l'hypothèse que ton récepteur est phosphorylé. Cela reste bien entendu une hypothèse car en effet c'est une extrapolation vu que ton anticorps ne reconnait que les tyr-P.

[invite9b44c3d1]

dans des exercices souvent on ne donne pas de PM, alors je vois pas trop l'intéret de cette expérience si on ne peut pas conclure que le récepteur est phosphorylé........
je suis assez perplexe là

[TanguyE]

Et t'as pas plus de détails sur l'Ac du western blot?

Parce que s'il est uniquement dirigé contre les tyr-P dans ce cas tu peux pas faire mieux que de supposer que ton récepteur soit phosphorylé.

Par contre s'il est dirigé contre ton récepteur uniquement dans sa version phosphorylée dans ce cas tu es sur que ton récepteur l'est. Parce que d'un part il est présent (expérience 1) et d'autre part l'Ac spécifique du récepteur phosphrylé le reconnait sur un western.

Par contre je reviens sur ta supposition que ton Ac reconnait quelque chose qui est phosphorylé et attaché au récepteur, ça me parait peu plausible vu que les migrations des extraits protéiques se font généralement en conditions dénaturantes.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

Par contre je reviens sur ta supposition que ton Ac reconnait quelque chose qui est phosphorylé et attaché au récepteur, ça me parait peu plausible vu que les migrations des extraits protéiques se font généralement en conditions dénaturantes.

Possible, mais rien n'exclut que ce quelque chose soit entrainé par l'IP, déposé sur un WB et reconnu par l'anti p-Tyr...

[invite9b44c3d1]

j'ai oublié de dire qu'apres l'immunoprécipitation avec anticorps antiA, on fait un western blot anti P tyr ET ANTI A (honte à moi xD)

dans ce cas là je suppose que je peux affirmer que le récepteur est phosphorylé, exact?

[TanguyE]

Possible, mais rien n'exclut que ce quelque chose soit entrainé par l'IP, déposé sur un WB et reconnu par l'anti p-Tyr...

C'est pas faux, j'avais pas considéré le fait que les deux expériences étaient à la suite

j'ai oublié de dire qu'après l'immunoprécipitation avec anticorps antiA, on fait un western blot anti P tyr ET ANTI A (honte à moi xD)

Dans ce cas si tu as qu'une seule tâche tu peux dire que ton récepteur est phosphorylé, puisque s'il y avait eu autre chose, ça aurait surement migré différemment.

[invite9b44c3d1]

merci de m'avoir éclairé