Fabrication d'une protéine d'intérêt ?

[inviteb3bd5afc]

Bonjour,
étudiant en terminale S spécialité biologie/écologie, je suis en pleine révision de biologie pour mon bac à venir. Mais en relisant mon cours sur le génie génétique je n'arrive pas à comprendre comment on produit une protéine d'intérêt.

J'ai les bases mais certains éléments manquent de détail comme la fabrication d'un ADNc et son rôle dans le protocole.
Je n'y vois pas clair non plus dans l'insertion du gêne d'intérêt dans le génome au niveau des gênes de résistance aux antibiotiques, etc...

Du coup si quelqu'un pouvait m'expliquer en détail toues les étapes et les mécanismes mis en jeu, cela me sera d'une grande aide pour mon épreuve.

Merci à vous.
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[invite75e918c6]

Salut !!

Ayant fait un projet tuteuré sur les protéines recombinantes, je peux essayer de t'aider.

Déjà, les processus de fabrication varient trop en fonction de la protéine d'intérêt mais il y a quasi toujours les mêmes étapes, c'est à dire:

- d'abord par bio-informatique, on choisi la séquence de gène qui code la protéine qu'on veut et on fait un ADN complémentaire qui est obtenue par une transcriptase inverse faite à partir de l'ARN (au lieu de faire ADN transcrit en ARN, on démarre de l'ARN qui est "transcrit" en ADN)
- ensuite cette séquence est insérée dans des cellules (procaryotes, eucaryotes ou végétales selon les exigences demandées) par combinaison.
- des gènes de résistance à l'ampicilline ou autre antibiotiques e tdes gènes de beta-galactosidase sont utilisées pour savoir si le gène est bien inséré (synthèse de la beta-gal) et pour pouvoir sélectionner les cellules qui vont synthétiser cette protéine (ça sert à rien de garder les cellules qui ne synthétisent pas la protéine en question)
-enfin, selon le mode de récup', soit les protéines sont excrété dans le milieu extracellulaire, soit on lyse les cellules et on récupère les protéines par chromatographie d'affinité ;-D

Tiens, je te donne un lien où je me suis inspiré pour mon projet
http://www.takween.com/biotechnologi...mbinantes.html

(bon, j'ai pas été très clair car faut que j'avance sur mon rapport, donc je répondrai aux questions si tu en as ;-D)

[piwi]

Bonjour.

Il manque une étape entre la production du cDNA et la transfection dans les cellules. Le cDNA est inséré dans un vecteur d'expression qui contient outre les éléments classiques d'un vecteur (Ori, MCS, marqueur de sélection) un promoteur de transcription ainsi qu'un RBS (ribosome binding site) qui va permettre la traduction du transcrit. Ceci est le minimum si on veut une protéine. Cependant, souvent, on aime bien ajouter une étiquette qui va faciliter la purification de la protéine (GST, FLAG, [HIS]₆, HA, etc...)

Ensuite vous faites votre transfection de bactéries ou de cellules eucaryotes. A noter que pour les cellules eucaryotes il existe deux types de transfection, stable (le vecteur s'insère dans le génome de la cellule) ou transitoire (le vecteur reste séparé du génome et finira par être éliminé).

Cordialement,
piwi

[Pfhoryan]

- d'abord par bio-informatique, on choisi la séquence de gène qui code la protéine qu'on veut et on fait un ADN complémentaire qui est obtenue par une transcriptase inverse faite à partir de l'ARN (au lieu de faire ADN transcrit en ARN, on démarre de l'ARN qui est "transcrit" en ADN)

Le plus simple est d'acheter un gène synthétique. C'est environ 50 centimes la base en ce moment.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite75e918c6]

Le plus simple est d'acheter un gène synthétique. C'est environ 50 centimes la base en ce moment.

Merci pour cette information, je ne savais pas que ça pouvait exister ce genre de commerce ^^

[invite2e21fee6]

Le plus simple est d'acheter un gène synthétique. C'est environ 50 centimes la base en ce moment.

c'est d'autant plus intéressant que tu peux demander à ce que cette séquence soit optimisée pour être produite dans l'organisme que tu choisis (coli par exemple)

Bien que le code génétique soit universel, certains codons sont utilisé de manière préférentielle d'un organisme à l'autre tu pourras voir si ta séquence est compatible avec ton organisme sur ce site (en choisissant une valeur d'utilisation)

http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html

cela peut très fort jouer sur la production de ta protéine

[piwi]

Il faut quand même prendre en compte l'aspect pécunier de ce genre de choses.
50c/b ça fait 500€ les 1000 bases.
1000 bases ça représente grosso modo une protéine de 350 aa ce qui n'est pas très grand. Avec un poids moyen de 145 Da par aa, on a un PM de ~50KDa.
En gros, ça fait 100€/KDa. C'est cher et il n'y a pas beaucoup de labo qui peuvent s'offrir cela pour toutes les applications.

Il y a une autre voie intermédiaire qui est de chercher si il n'existe pas la séquence que l'on cherche dans des banques de plasmides. Là c'est beaucoup moins cher, un peu moins de 100€ le vecteur.

Cordialement,
piwi

[invite4ff72fd5]

Il faut quand même prendre en compte l'aspect pécunier de ce genre de choses.
50c/b ça fait 500€ les 1000 bases.
1000 bases ça représente grosso modo une protéine de 350 aa ce qui n'est pas très grand. Avec un poids moyen de 145 Da par aa, on a un PM de ~50KDa.
En gros, ça fait 100€/KDa. C'est cher et il n'y a pas beaucoup de labo qui peuvent s'offrir cela pour toutes les applications.

Il y a une autre voie intermédiaire qui est de chercher si il n'existe pas la séquence que l'on cherche dans des banques de plasmides. Là c'est beaucoup moins cher, un peu moins de 100€ le vecteur.

Cordialement,
piwi

Je confirme.
Il faut vraiment voir, suivant les protéines ça peut être rentable temps/prix mais dès que ta protéine est grosse là c'est beaucoup moins rentable.
Ce qui est globalement encourageant c'est que ce genre de services risque de se démocratiser et les prix baisser (j'espère) du coup plus tard ça sera vraiment rentable.

[inviteb3bd5afc]

Il manque une étape entre la production du cDNA et la transfection dans les cellules. Le cDNA est inséré dans un vecteur d'expression qui contient outre les éléments classiques d'un vecteur (Ori, MCS, marqueur de sélection) un promoteur de transcription ainsi qu'un RBS (ribosome binding site) qui va permettre la traduction du transcrit. Ceci est le minimum si on veut une protéine. Cependant, souvent, on aime bien ajouter une étiquette qui va faciliter la purification de la protéine (GST, FLAG, [HIS]₆, HA, etc...)

KESAKO? Je ne suis qu'un humble terminale et là j'avou que je suis largué. C'est quoi un vecteur d'expression? Un RBS et les étiquettes?

[invite853321bf]

Un vecteur d'expression est un plasmide (un morceau d'ADN spécifique des bactéries) circulaire qui a été trafiqué dans sa séquence pour être utilisé pour exprimer des protéines. En gros, on utilise habituellement des enzymes de restriction pour couper l'ADN et introduire de l'ADN, ce plasmide en contient beaucoup, positionner après un site qui induira la trancription du fragment ajouté en ARN.
Etiquettes, ce sont souvent des bouts de protéine qui fluoresce, on fait en sorte que notre ADN sera introduit juste après l'ADN correspondant à ces protéines, ainsi les deux protéines seront créées ensemble, et on sera sur que la construction fonctionne

Et RBS = Ribosome Binding Site donc littéralement site de liaison du Ribosome, structure assurant la transcription

[Pfhoryan]

Je confirme.
Il faut vraiment voir, suivant les protéines ça peut être rentable temps/prix mais dès que ta protéine est grosse là c'est beaucoup moins rentable.

Oui, quand tu inclues le prix que te coûte un technicien (dans les 150 euros/jour) cela peut vite devenir rentable. Et puis l'optimisation de codons, la possibilité de mettre des sites de restrictions pratiquement où on veut, c'est fort pratique. Par exemple, il suffit de découper le gène en cassettes de 200 bp, flanquées de sites de restrictions courants, et si on veut faire des mutants, il suffit juste de changer la cassette par une nouveau fragment de synthèse. çà revient actuellement à environ 150 euros le fragment, avec autant de mutations qu'on veut dans le fragment choisi ... et il y a toujours moyen de négocier les prix pour un projet de grande ampleur.

Ce qui est globalement encourageant c'est que ce genre de services risque de se démocratiser et les prix baisser (j'espère) du coup plus tard ça sera vraiment rentable.

Comme pour ce qui s'est passé pour le séquençage d'ADN ou la synthèse d'oligos. Au rythme actuel, dans 5 ans, plus personne ne fera de mutants maison

[invite853321bf]

Oui, quand tu inclues le prix que te coûte un technicien (dans les 150 euros/jour)

Euh si t'embauches, je suis intéressé

[TanguyE]

Euh si t'embauches, je suis intéressé

Désolé de te décevoir, mais il a dit "le prix que coûte" pas le salaire (et y'a quand même une différence, le cout correspondant environ au double du salaire)

[piwi]

Même dans ces conditions, le salaire du technicien reste un peu surévalué.
150 x 30 = 4500
Même si on divise par deux pour avoir le salaire net on aura 2250 €/mois. Doit pas y avoir beaucoup de techniciens avec ce salaire.

Cordialement,
piwi

[invite853321bf]

On va pouvoir enlever encore quelques €, on travaille 22-23 jours par mois en France. Ca reste quand même un bon salaire pour un technicien.

[TanguyE]

J'ai toujours été une chèvre en calcul mental

[inviteb3bd5afc]

vous vous écartez un peu du sujet là non?

[Pfhoryan]

On va pouvoir enlever encore quelques €, on travaille 22-23 jours par mois en France. Ca reste quand même un bon salaire pour un technicien.

Dans les EPST (CNRS, INSERM...), on compte 43000 euros/an dans les demandes financières pour un salaire de technicien (chargé et taxé).