Contamination non identifiée

[invite9f470663]

Bonjour !

S'il est possible d'avoir un peu d'aide ... ce serait juste génial !
Je fais actuellement de la culture cellulaire entre autre dans le cadre d'un projet de recherche. Seulement depuis un peu plus d'un mois à chaque fois que l'on décongèle un cryotube de cellules (ce sont des fibroblastes pulmonaires humains normaux, chaque cryotube provient d'une même personne, est conservé au même endroit à -144°C et est sensé être pur) il se développe à l'intérieur de nos cultures quelque chose qu'il nous est impossible d'identifier et qui les détruit. Il y a à la fois des "paquets" de formes relativement circulaires et de couleur marron vu sous un simple microscope optique, qui semblent se développer sur les cellules en culture. Et à la fois des bactéries. Il y aurait un lien entre ces deux puisqu'il apparaissent sensiblement en même temps, sans trop savoir qui est la conséquence de quoi. Impossible de savoir ce qui provoque ça ni ce que c'est...encore moins comment s'en débarrasser ! Alors si quelqu'un a une idée ! Merci !
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[invite71f23525]

Bonjour,

Ce genre d'aggrégat se produit lorsqu'il y a de la lyse cellulaire après décongélation, ce qui provoque l'aggrégation des cellules lysées. Lors de la décongélation de cellules, il n'est pas rare après avoir adhérer qu'elles aient des débris cellulaires collés à leur membrane. Il s'agit des cellules qui n'ont pas supporté la congélation/décongélation, qui se sont lysées puis collées sur les cellules adhérentes. Il est donc normal qu'après décongélation tu obtiennes dans ta culture des débris collés sur les cellules et des aggrégats. Cependant, si ces problèmes persistent après avoir changé le milieu de culture et avoir commencé les repiquages, c'est pas normal. Si tu as un autre lot d'ampoules de ces cellules congelées, je te conseille de le tester. En effet, certaines congélation peuvent être loupées et elles peuvent avoir fait dérivé tes cellules, ou être contaminées.

As-tu vérifié si tes cellules sont mycoplasmées? Es-tu sûre qu'il y a une contamination bactérienne car les clichées ne m'en donnent pas l'impression?

[invite9f470663]

Tout d'abord merci beaucoup pour ta réponse.
Je vais essayer de donner plus de détails parce que mon premier message est assez général et ne rend pas bien compte de tout.
Pour répondre à tes questions :
- je suis certaine de la contamination bactérienne, on ne la voit effectivement pas sur ces clichés (magnification 10x seulement) mais à 40x pas de doutes possibles. De plus le milieu est partuclièrement trouble, caractéristique.
- également sûre qu'il n'y a pas de mycoplasmes, quand cela a commencé on a tout de suite pensé à ça, plusieurs échantillons ont été envoyé pour analyses --> négatif.
Ces problèmes ont commencés fin mai environ. Avant cela nous utilisions les mêmes cellules, provenant du même endroit, différents cryotubes étaient décongelés sans que jamais ces "agrégats" soient observables et les cultures étaient parfaitement saines. Puis ça a commencé dans l'une de nos culture. Seule une plaque 6 puits était touchée. Et petit à petit les autres cultures de ces même cellules, cultivées dans le même incubateur, mais provenant d'autres cryotubes ont été atteintes, indépendamment du contenant. Après avoir tout nettoyé de nouveaux cryotubes ont été décongelés. Il s'est produit la même chose : agrégats marrons et bactéries. On a donc décidé d'arrêter la culture cell pour tout nettoyer de fond en comble. Des échantillons ont été envoyés pour analyses : pour ce qui est des bactéries il s'agissait à priori de Ralstonia Picketti. Après 1 mois de nettoyage intensif, on recommencé à décongeler des cellules (provenant de nouveaux cryotubes sensés être purs, même cellules) et il s'est de nouveau produit ça. Encore une fois des échantillons ont été envoyés pour analyse, nous n'avons pas encore les résultats. Un point important : il faut environ en moyenne 3 jours (assez variable) après décongélation avant que n'apparaissent dans une culture ces cercles marrons et des bactéries, sensiblement en même temps. Avant cela tout est normal, le milieu est même changé deux fois de suite le lendemain de la décongélation.

Il y a quelque chose c'est sûr...que je ne comprends pas ! Je ne voudrais pas que ce soit à cause de moi (manip...) mais pour le savoir il faudrait comprendre ce que c'est.

[invite71f23525]

Fais-tu tes cultures avec un antibiotique dans le milieu de culture? Les cryotubes que tu décongèles sont-ils des congélations réalisées le même jour par la même personne? As-tu essayé de décongeler des cellules qui ont été congelées bien avant celles où tu as commencé à avoir tes problèmes? As-tu essayé de décongeler une autre lignée cellulaire, un autre type cellulaire?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9f470663]

Alors il y a dans le milieu des antibiotiques et des antimitotiques. Les cryotubes utilisées ont effectivement été congelés le même jour par la même personne, seulement avant cela ces mêmes cryotubes ont déjà été utilisés sans qu'il y ait de problèmes...seule petite chose : les cryotube ont été changés de lieu de stockage (un autre -144) mais je ne me souviens pas précisément quand donc impossible de savoir si il pourrait y avoir un lien. Nous n'avons plus de cellules qui ont été congelés avant cela donc impossible. Une autre lignée ou plutôt des cellules souches ont été aussi décongelées (human lung mesenchemal stem cells). Elles ne sont pour le moment pas contaminées. Après avoir discuté avec plusieurs personnes faisant de la culture cellulaire on pense que cela pourrait être des champignons ... si c'est le cas reste à savoir d'où ils viennent, est ce qu'ils sont présents dans les cryotubes avant la décongélation (problème lors du freezing, problème lors du stockage à -144°C...), est ce que c'est pendant la décongélation, ou pendant la culture dans l'incubateur (ça j'en doute puisqu'il a été lavé, autoclavé ect...) ???