Electrophorèse SDS page

[invite947aff3b]

Bonjour,

J'aurais besoin de vos avis/conseils:
J'effectue des gels en SDS page en acrylamide 4-15 %.
J'obtiens quasiment à chaque fois des stries verticales que vous pouvez voir sur la photo. Une seule fois je n'ai pas eut de stries comme vous pouvez voir sur l'autre gel, j'ai pourtant reproduit les mêmes conditions opératoires.
Quelles peuvent être les causes?
Plutôt au niveau de la solubilisation de mes échantillons ? ajout de SDS, urée et Tris HCl?
Ou purement au niveau de l'électrophorèse?
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[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Qu'est-ce que tu déposes comme échantillon sur tes gels : protéine recombinante (j'en doute), extrait cellulaire? Avec quoi tu colores : bleu de Coomassie, Simply Blue,...? Ce que tu appelles "bandes verticales", ce ne serait pas plutôt des bandes horizontales,...? Essayes d'être plus précis.

[invite252e8806]

Bonjour,

Bon je suis nouveau également sur le forum, mais actuellement je suis sur un sujet de protéine pour mon mémoire et je dois donc faire de nombreux gels d'éléctrophorèses. Effectivement, j'ai déjà vu ce genre de problème.

Es ce que ta solution pour faire ton gel est bien homogène?
Comment fais-tu tes gels ?
Es ce que ton appareil à migration fonctionne bien? ( je pense au fil conducteur, equilibre des charges quoi)
Es ce que tu migrerais pas trop vite? trop de voltage?
Es ce que tu charge la même quantité dans chaque puit?


Voilà à quoi je pense!

J'espère que ça t'aidera!

Droopx

[invite947aff3b]

Je dépose de la fibrine synthétisée in vitro et solubilisée par de l'urée, SDS et Tris HCl.
Je parle bien de "traînées" verticales qui créent un "bruit de fond" c'est à dire une traînée q'on a tout le long de la migration, une sorte de voile bleu clair que tu vois bien sur le 1er gel et que tu n'a pas sur le 2ème.
Les bandes protéiques horizontales sont bien visibles mais en fond tu as un voile bleu beaucoup plus clair.
Est-ce plus clair? Je colore au bleu de Coomassie

En ce qui concerne le matériel, il est neuf, les gels sont achetés coulés :P, j'ai fais des tests avec différents paramètres de migration plus ou moins lents : pas de changements, et j'ai déposé plusieurs concentrations de protéines pour effectuer mes réglages : pas de changements au niveau des traînées non plus!
J'ai réussi à ne pas avoir de traînée uniquement une fois (gel 1) et je ne sais pas ni le reproduire ni l'expliquer...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite252e8806]

Alors effectivement, je pensais moi que tes bandes migraient de coté. Mais pour le bruit de fond, es ce que ta fibrine synthétisée est bien pure?

Sinon, j'ai recherché un peu sur internet et c'est peut être dû à l'urée ou au sel de ton tampon de solubilisation.

Simple question pour ma culture pourquoi mets-tu SDS et Urée dans le même tampon?
Urée pour dénaturé les protéines mais il me semble que SDS joue le même rôle?

Enfin bon j'espère t'aider encore!

Bonne journée

[invite947aff3b]

Je met SDS et urée justement pour ne pas avoir une concentration trop élevée en urée à mettre ce qui pose déjà problème dans mon dosage de protéine que j'effectue avant de déposer mes échantillons, juste après la solubilisation.
Idem pour le SDS. Mais en soit à la base ils jouent le même rôle seulement j'ai fait pas mal de tests et pour mes échantillons, le fait de coupler les deux réduit considérablement le temps de solubilisation de mes échantillons.
J'ai également penser au sels, je fais essayer de résuire encore mes concentrations en urée/SDS/TrisHCl pour ma solubilisation mais ça va être coton!

[inviteb753ced1]

Hello

Le bruit de fond peut être tout simplement dû à des protéines contaminantes issues de ta synthèse in vitro (utilises-tu des réticulocytes ?), protéines ayant différents poids moléculaires ce qui crée au final ce continuum à l'oeil nu. Sur ton gel en l'occurrence, ce ne sont pas des stries verticales "localisées" comme tu le suggérais dans ton premier post (car stries verticales = traits verticaux). Et puis ne vois-tu pas quelquechose de bizarre sur la seconde photo ? Oui, c'est flou ! J'ai chaussé mes lunettes, rien à faire

Question bête, mais est-ce vraiment un problème ce bruit de fond ? Du moment que tu vois tes bandes d'intérêts (je suppose à la bonne taille ?).

Pour les bandes restées tout en haut (notamment pour les puits 3 à 6 du premier gel en partant de la gauche), on dit souvent que c'est dû à une dénaturation incomplète (mettre alors plus de b-mercapto ou de DTT et/ou chauffer à 95°C plus longtemps).

Pour se débarrasser du bruit de fond, je te propose de laisser ton gel dans la solution de décoloration plus longtemps que tu ne l'as fait précédemment, en changeant régulièrement ton bain de décoloration quand celui-ci devient trop saturé (c'est à dire tout bleu). Le bruit de fond étant moins intense que tes bandes d'intérêts, elles vont disparaître avant. La coloration au bleu de Coomassie est réversible, tu pourras au besoin recommencer la coloration en mettant ton gel de nouveau dans la solution de bleu de Coomassie.

Dis-moi si ça marche.

A+

[invite947aff3b]

Non je n'utilise pas de réticulocytes pour ma synthèse.

Non ce n'est pas très important le bruit de fond mais c'est par simple satisfaction et étant donné que j'analyse les gels uniquement à l'oeil, je préférais ne pas avoir de bruit de fond!
En ce qui concerne la netteté du gel 2 cela vient uniquement de la photo.
Je vais essayer ta technique pour la décoloration, je te redis.
Merci pour l'info des bandes en haut des puits! Tu parles de chauffer à 95°C mais à quel moment et combien de temps environ? une fois que j'ai mis mon tampon avec mon échantillon?

Merci des infos en tout cas!

[inviteb753ced1]

Non je n'utilise pas de réticulocytes pour ma synthèse.
En ce qui concerne la netteté du gel 2 cela vient uniquement de la photo.
Je vais essayer ta technique pour la décoloration, je te redis.
Merci pour l'info des bandes en haut des puits! Tu parles de chauffer à 95°C mais à quel moment et combien de temps environ? une fois que j'ai mis mon tampon avec mon échantillon?

Merci des infos en tout cas!

Qu'utilises-tu alors pour la synthèse ? Ne sois pas si avare de détails Mais oui bien sûr j'avais compris que c'était ta photo qui était floue, pourquoi l'avoir postée alors puisqu'on ne voit rien ?

Pour les bandes en haut : on s'accorde à dire que ça serait dû à un manque de dénaturation des protéines : tu peux donc augmenter le pouvoir réducteur de ton tampon de charge (augmenter alors la quantité de b-mercapto ou de DTT) et chauffer plus longtemps. A quel moment ? Et bien comme normalement on a dû te l'expliquer si ton encadrant direct est reponsable : après avoir mis ton tampon de charge et juste avant de charger les échantillons sur ton gel ! En général, on fait 5 min à 95C.

Il est bon de s’interroger sur ces détails pour comprendre le fonctionnement et les principes généraux. Avec la pratique, tu verras que ce sont des détails, une fois maitrisés, secondaires : que tu chauffes 4 min à 92 C au lieu de 5 min à 95C, tu ne verras pas la différence sur ton gel.

[invite947aff3b]

Qu'utilises-tu alors pour la synthèse ? Ne sois pas si avare de détails Mais oui bien sûr j'avais compris que c'était ta photo qui était floue, pourquoi l'avoir postée alors puisqu'on ne voit rien ?

Pour les bandes en haut : on s'accorde à dire que ça serait dû à un manque de dénaturation des protéines : tu peux donc augmenter le pouvoir réducteur de ton tampon de charge (augmenter alors la quantité de b-mercapto ou de DTT) et chauffer plus longtemps. A quel moment ? Et bien comme normalement on a dû te l'expliquer si ton encadrant direct est reponsable : après avoir mis ton tampon de charge et juste avant de charger les échantillons sur ton gel ! En général, on fait 5 min à 95C.

Il est bon de s’interroger sur ces détails pour comprendre le fonctionnement et les principes généraux. Avec la pratique, tu verras que ce sont des détails, une fois maitrisés, secondaires : que tu chauffes 4 min à 92 C au lieu de 5 min à 95C, tu ne verras pas la différence sur ton gel.

Bon alors je détail lol!
J'utilise du fibrinogène humain, NaCl, CaCl2 (hépès) et de la thrombine pour synthétisé ma fibrine
Un gel de fibrine se forme et je solubilise ce gel avec de l'urée/SDS et TrisHCl et je chauffe à 90 °C pendant 3h!
C'est pourquoi je ne chauffe pas mes échantillons une nouvelle fois quand j'ai mis mon tampon de charge, devrais-je le faire quand même?

Pour la photo on voit quand même un peu