Tampon SSC 20x

[invite10adf645]

Bonjour,

je préparer une manip d'hybridation in situ et j'ai quelques problèmes avec le tampon SSC (150mM NaCl, 15mM citrate de sodium, pH7,2).
Je dois préparer du 20X, donc je pèse 175,3g de NaCl et 88,2g de citrate de sodium pour 1L d'eau (je met 900ml pour ajuster le pH à la fin).
Seulement ça ne se dissout pas, même après une nuit sous agitation.
C'est pourtant le tampon classique, retrouvé dans moultes protocoles.
Est-ce que j'ai oublié quelque chose ? Il faut chauffer ?

merci de votre aide !
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[inviteae6c05c4]

Bonjour,

Et en ajoutant petit à petit sous agitation ?

[invite10adf645]

Ca ne revient pas au même au final ?

[inviteae6c05c4]

Tout dépend du produit... il y a certaines poudres (par exemple, la BSA) qui vont très mal se dissoudre si on verse une grosse quantité d'un coup, alors qu'en ajoutant progressivement cela ne pose pas de problème. Il faut attendre que ce que l'on vient de mettre soit dissout avant d'en ajouter. C'est contraignant mais rien n'empêche de faire autre chose à côté en attendant que ça se passe.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite10adf645]

J'essaierai pour la prochaine fois au cas où (ça coute un peu cher vu la quantité de citrate et la pureté).
Pour info, j'ai ajouté de l'eau jusqu'à 2L et ça s'est dissout. Faudra juste adapter pour un tampon à 10X.

[piwi]

Bonjour.

Êtes vous certain d'avoir mis les bons composés dans les bonnes proportions (celles que vous indiquez sont correctes)? Normalement, le SSC 20X n'est pas une solution difficile à réaliser. Quel était le pH une fois que vous avez ajouté vos 900 ml de flotte?

Cordialement,
piwi

[invite10adf645]

J'ai retrouvé les même calculs dans plusieurs protocole (y compris la masse de produits à peser).
Pour le pH, je ne l'ai pas fait après avoir mis 900ml car il y avait vraiment beaucoup de cristaux en agitation (aspect laiteux). Mais dans 2L d'eau, le pH était autour de 3,5 et j'ai passé une bonne cinquantaine de pastilles de soude pour le ramener à 7,2.
Est-ce que le fait d'être très acide peut empêcher la dissolution complète des sels ?

Si j'ai droit à une question subsidiaire : est-ce que je peux traiter ce tampon au DEPC 0,1% et l'autoclaver ? J'ai lu que le Tris réagissait avec le DEPC et qu'il ne fallait pas le traiter (en espérant que le pot de Tris commun soit exempt de RNases, ce dont je doute)

merci beaucoup !

[invite98ab1ae6]

Hi!
Pour le DEPC, il me semble que je traitais l'eau seulement, que j'utilisais pour realiser toutes mes sauces, et toute la vaisselle etait reservee a des manips de RNA.
Mais c'etait il y a un moment, je peux me tromper...

Et je ne me rappelle pas avoir du soucis comme ca pour preparer du SSC...

Courage!

[piwi]

Pour l'in situ, ne vous embêtez pas avec le DEPC, ça ne sert à rien. Solutions propres, c'est suffisant.

Cordialement,
piwi

[invite10adf645]

OK ça me rassure un peu (les RNases c'est un peu le croc-mitaine pour les grands !)

En fait je me suis préparé 10L d'eau DEPC pour faire mes sauces, dans de la verrerie que je passe 4h au four à 240°C (après lavage à l'eau démineralisée).

J'ai quand même passé mon PBS et mon TBS au DEPC overnight, puis autoclavé. Si j'ai bien compris, je n'ai pas besoin de refaire le tampon Tris alors (le DEPC est dégradé par le Tris, mais pas inversement ?).

Quant au SSC, je vais me contenter du 10X pour le moment et élucider ce mystère un autre jour (je testerai le chauffage et les pastilles de soude).

[piwi]

Pour le SSC la recette que vous avez utilisé est la bonne. Cependant, le comportement étrange de la solution lors de sa préparation incite à la méfiance. Quelque chose ne c'est pas passé comme elle aurait du. Juste pour être certain de votre coup, avec vous une possibilité de préparer un petit volume (250 ml) d'une nouvelle solution SSC?
Est-il possible que vous ayez confondu deux flacons? Que vous ayez mal considéré ce que disait la balance? Ce sont des choses qui arrivent. Evidemment, quand on pose la question la réponse est toujours "non, j'ai fais super gaffe". Mais pourtant... On ne s'en rend jamais compte que on fait des erreurs. Sinon, nous ne les ferions pas.

Cordialement,
piwi

[invite10adf645]

Non, j'ai fait super gaffe

Enfin pour en avoir le coeur net, je vais refaire un volume de 20X en revérifiant tout 2 fois. Puis j'ajouterai quelques pastilles de soude voir si ça change quelque chose, et si toujours pas, j'essaierai de chauffer à 50/60°C.

Je vous tiens informé.

[invite10adf645]

Alors résultat très rapide :

au lieu de mettre l'eau sur le mélange de poudre NaCl/Citrate, j'ai d'abord mis le citrate seul dans l'eau. C'est bien lui qui est insoluble. Le NaCl se dissout rapidement quand je l'ajoute par la suite.

Par contre j'ai ajouté beaucoup (énormément) de pastilles de soude dans la bouteille et Ô miracle, ma solution s'est éclaircie ! Là je continu d'ajouter de la soude car le pH est difficile à faire remonter mais la solution est limpide !

C'est quand même étrange que je n'aie vu ce détail sur aucun protocole...
Le citrate que j'ai utilisé est anhydre. Est-ce que mon problème peut venir de là ?

[piwi]

Possiblement, classiquement (et c'est ce qu'on utilise au labo) on utilise Na₃C₆H₅O₇ 2H₂O

N'ayant pas préparé moi même cette solution depuis un bail, j'ai été pris d'un doute. Du coup je viens à l'instant d'en préparer 50 ml. La dissolution est très rapide. Un bon coup de vortex (ou agitateur) et c'est réglé (sans ajuster le pH le moins du monde au préalable).

Cordialement,
piwi

[invite10adf645]

Eh bien je le saurai pour la prochaine fois !

Enfin je garde ma solution comme ça, ça ne dois pas faire de grande différence au final, mis à part la difficulté de la préparation.

Ca a un peu chauffé au passage (dans les 30-40°C je dirai), mais pas de quoi fausser significativement mon pH j'imagine.

En tout cas merci pour le support !!