Extraction d'ADN par les sels (salting out)

[yassmine]

J'ai fait une extraction d'ADN par salting out mais je crois que je ne l'ai pas réussi je pense au fait que j'ai trop vortexé après l'ajout du NaCl à 6 molaires qui a pu peut être casser l'ADN. je voudrais savoir ce que vous en pensez.

J'ai aussi filtré le SLR et le SLB avec un filtre, est ce que le filtre n'a pas éliminé quelque chose des solutions ?!

- Dans mon protocole il est dit qu'on doit incuber une nuit à 37°C sous agitation, mais au labo il y avait qu'un bain marie sans agitateur est ce que cela peut empêcher l'apparition de la méduse ?

- J'ai une question aussi concernant le lavage avec 1ml d'éthanol 70% après récupération avec une pipette Pasteur, il est dit d'éliminer ensuite cette éthanol et de refaire cette étape selon le besoin, est ce que 1ml peut s'évaporer en laissant le micro tube ouvert ou bien dois-je l'éliminer avec la micro pipette.
Et qu'elles sont les condition de stérilité, est ce que la micri pipette utilisée doit passer par une flamme pour être stérilisée ?

-dernière question il est dit à la fin du protocole qu'une fois l'ADN séché resuspendre avec de l'eau distillée ou le tampon TE, mais on ne donne pas la quantité. Est ce que ce n'est pas forcément précis, et ne fausse pas l'estimation de la concentration de l'ADN par la suite ?

Je débute dans la manipulation et je voudrais savoir ce qui a cloché dans ma première manip
Je vous remercie pour les réponses et l'aide que vous m'apporterez
-----

[gorben]

Salut,

Tu n'es pas assez precise.

Pourquoi est ce que tu dis que ca n'a pas marche?
Tu pars de quoi comme materiel?
Qu'est ce que tu veux isoler? ADNg ou plasmide?
Quel est ton protocole?

A+

[yassmine]

Pour être plus précise une fois l'éthanol à 70% ajouté je devrais obtenir la méduse de couleur blanchâtre or que j'ai eu quelque chose de pas visqueux comme l'ADN et de couleur bleue ce qui 'a beaucoup surpris. J'ai quand même fait une électrophorèse et j'ai obtenu une trainé peut être une contamination

J'ai utilisé du sang 5ml je me suis dit c'est peut être insuffisant et c'est pour extraire de l'ADN génomique.

Voilà le protocole que j'ai utilisé, on l'a déjà suivie et ça a marché mais là je ne sais pas où j'ai loupé


1. Prélever 10 ml de sang dans un tube avec anticoagulant.
2. Transférer dans un tube de 50 ml.
3. Compléter à 45 ml avec la solution SLR glacée, mélanger puis mettre les tubes dans de la glace pendant 20 min.
4. Centrifuger à 5000 tpm pendant 15 min à 4°C, puis éliminer le surnageant constitué de globules rouges lysés.
5. Répéter les deux précédentes étapes jusqu’à éclaircissement du culot.
6. Resuspendre le culot constitué de globules blancs dans 2 ml de solution
SLB, puis ajouter 300 μl de SDS 10% et 20 μl de Proteinase K (10 mg/ml).
7. Incuber durant toute une nuit à 37°C sous agitation.
8. Ajouter 1 ml de NaCl 6 M et agiter vigoureusement pendant 15-20 secs.
9. Centrifuger à 5000 tpm pendant 15 min à 4°C.
10. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 ml.
11. Ajouter 2 volume d’Ethanol absolu 100% glacé et mélanger doucement par retournement jusqu’à apparition de la méduse d’ADN.
12. Récupérer la méduse avec une pipette Pasteur et la transférer dans un microtube de 1.5 ml.
13. Laver la méduse avec 1 ml d’Ethanol 70% puis éliminer l’éthanol.
14. Répéter l’étape précédente une à deux fois selon le besoin.
15. Laisser sécher l’ADN à température ambiante.
16. Ajouter de l’eau distillée ou du tampon TE et laisser la méduse se resuspendre à 4°C

[gorben]

Salut,

J'ai fait une extraction d'ADN par salting out mais je crois que je ne l'ai pas réussi je pense au fait que j'ai trop vortexé après l'ajout du NaCl à 6 molaires qui a pu peut être casser l'ADN. je voudrais savoir ce que vous en pensez.

Pour moi la raison est ici. Je suis loin d'etre un expert en exctraction d'ADN eucaryote, mais es tu sure que tu devais vortexer a cette etape? Le vortex casse bien l'ADN. Pour moi tes cellules devraient deja etre lysees avant ca. C'est pas cense etre fragile des cellules eucaryotes?

Dans mon protocole il est dit qu'on doit incuber une nuit à 37°C sous agitation, mais au labo il y avait qu'un bain marie sans agitateur est ce que cela peut empêcher l'apparition de la méduse ?

Non, ca ca ne change rien (ou presque)

J'ai une question aussi concernant le lavage avec 1ml d'éthanol 70% après récupération avec une pipette Pasteur, il est dit d'éliminer ensuite cette éthanol et de refaire cette étape selon le besoin, est ce que 1ml peut s'évaporer en laissant le micro tube ouvert ou bien dois-je l'éliminer avec la micro pipette.
Et qu'elles sont les condition de stérilité, est ce que la micri pipette utilisée doit passer par une flamme pour être stérilisée ?

Non tu dois enlever le lavage, sinon tu ne laves pas
En plus evaporer 1 ml, meme de l'ethanol 70% ca va te prendre plusieurs heures..

dernière question il est dit à la fin du protocole qu'une fois l'ADN séché resuspendre avec de l'eau distillée ou le tampon TE, mais on ne donne pas la quantité. Est ce que ce n'est pas forcément précis, et ne fausse pas l'estimation de la concentration de l'ADN par la suite ?

Tu ressuspends au "feeling". Plus ton volume est grand, plus ton ADN sera dilue. Dans tous les cas si tu veux etre precis tu dois quantifier. Perso j'utilise ni de l'eau ni du TE, mais du tris 10mM pH 8.0. L'EDTA du TE peut inhiber pas mal de reaction, c'est souvent un peu chiant. L'eau risque de ne pas etre au bon pH et de mal eluer/resuspendre l'ADN

Pour moi ton probleme vient soit d'une mauvaise manipulation (trop brusque, l'ADN s'est casse) soit d'une contamination par une DNAse.

Bon courage

[A voir en vidéo sur Futura]

[yassmine]

Salut,


Pour moi la raison est ici. Je suis loin d'etre un expert en exctraction d'ADN eucaryote, mais es tu sure que tu devais vortexer a cette etape? Le vortex casse bien l'ADN. Pour moi tes cellules devraient deja etre lysees avant ca. C'est pas cense etre fragile des cellules eucaryotes?


Non, ca ca ne change rien (ou presque)


Non tu dois enlever le lavage, sinon tu ne laves pas
En plus evaporer 1 ml, meme de l'ethanol 70% ca va te prendre plusieurs heures..


Tu ressuspends au "feeling". Plus ton volume est grand, plus ton ADN sera dilue. Dans tous les cas si tu veux etre precis tu dois quantifier. Perso j'utilise ni de l'eau ni du TE, mais du tris 10mM pH 8.0. L'EDTA du TE peut inhiber pas mal de reaction, c'est souvent un peu chiant. L'eau risque de ne pas etre au bon pH et de mal eluer/resuspendre l'ADN

Pour moi ton probleme vient soit d'une mauvaise manipulation (trop brusque, l'ADN s'est casse) soit d'une contamination par une DNAse.

Bon courage

merci pour ton aide ... effectivement j'ai dû casser l'ADN en vortexant brutalement, j'ai refait en faisant attention à ça et ça a très bien marché, une concentration assez importante.

merci beaucoup pour ton aide encore une fois