Transfection plasmide B-gal sur 3T3

[invite830b04e3]

Bonjour,

Je rencontre un problème depuis quelques mois déjà sur une technique de transfection.
En exergue, je précise que j'ai débuté la culture cellulaire mi-mai, que je n'en avais jamais fait avant, et que je rate systématiquement cette manip depuis juin (environ 6-7 tentatives).

Je dois effectuer une transfection de plasmide B-galactosidase dans des cellules 3T3. Voila le principe de la dernière manip effectuée.

Le lundi, j'ensemence des boites de 24 puits à différentes concentrations, respectivement:
- 20 000 cellules / cm² (3 puits)
- 25 000 cellules / cm² (3 puits)
- 40 000 cellules / cm² (3 puits)
Je répartis 500 µl de mes solutions dosées dans chaque puit.

Le mardi, j'effectue ma transfection avec des solutions de plasmides différemment concentrées:
- solution de plasmide à 0,5 µg (3 puits)
- solution de plasmide à 0,75 µg (3 puits)
- solution de plasmide à 1,5 µg (3 puits)

Le jeudi, je fixe mes cellules (solution PFA 2% avec lavage) puis je révèle avec 500 µl de solution X-gal par puit.

Normalement, je devrais obtenir des colorations bleus dans chaque puit, avec un gradient de coloration apparent. Or, je n'ai.... rien du tout. Aucune coloration. Ma collègue, qui a plus de 20 ans de culture cellulaire, y arrive très bien, elle. Elle dit qu'elle comprend pas. Moi non plus...

Je désespère d'y arriver. Vous auriez des suggestions?

Merci d'avoir lu mon pavé,


PS Je précise que j'ai déjà essayé de changer des paramètres, tel que changement de pipette en cas de mauvais pipetage. On m'a dit que mes cellules forment des amas au centre des puits, et que c'est ca qui gêne. Comment faire pour s'en débarrasser? J'ai beau remuer, rien n'y fait.
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[invite12cad8f0]

Bonjour Katzuk

Tout d'abord, peux-tu préciser quelle technique tu utilises pour transfecter tes cellules ? AAV, Adeno (a priori non puisque tu parles de transfection et non d'infection), Liposome, Electroporation ... ?

Pour la densité de cellules lors de l'ensemencement, il faut faire en sorte que tes cellules soient à environ 80% de confluence au moment où tu transfectes. Je ne sais pas comment poussent les fibroblastes, mais pour comparaison, j'ensemence 70 000 cellules HeLa ou HEK par puits dans 1mL de milieu et le lendemain c'est bon.
Mais pour répondre à la remarque qu'on t'a faite : oui, les cellules qui se mettent en amas, c'est une grosse galère à transfecter !

Le mardi, j'effectue ma transfection avec des solutions de plasmides différemment concentrées:
- solution de plasmide à 0,5 µg (3 puits)
- solution de plasmide à 0,75 µg (3 puits)
- solution de plasmide à 1,5 µg (3 puits)

Pour ton plasmide, tu as raison de faire varier ta quantité. Quand tu dis préparation à 0.5µg (3 puits), tu déposes 0,5µg par puits ou bien 0,5µg pour 3 puits ? Normalement 500ng pour un puits ça suffit, surtout pour la B-Gal.

Tu es sûr(e) que ton PFA est de bonne qualité ? dans du PBS ?
Est-ce que tu essayé avec du méthanol ?
Ton X-Gal aussi est en forme ?

Dans tous les cas, il y a forcément une étape qui diffère entre ta manip et celle de ta collègue. Vous devriez faire la manip tous les 2 en même temps en parallèle et vous regarder l'un l'autre, vous devriez voir ce qui ne va pas.

J'attends ta réponse pour la technique de transfection

[piwi]

Une solution est que la technicienne essaie avec vos solutions, ou que vous essayiez avec les siennes. Ca éliminera le paramètre expérimentateur. Ensuite, vous avisez.