bonjour à tous,
j'étudie les modifications post-traductionnelles d'une protéine exprimée dans les cellules HeLa. Je n'ai pas vu de phosphorylation de la protéine immunoprécipitatée. Je voudrais voir maintenant si elle est poly-ADP-Ribosylée mais je ne dispose pas d'anticorps anti-PAR. Existe-t-il d'autres approches que je pourrais utiliser pour la mise en évidence d'une Poly-ADP-ribosylation ?
NB : ma protéine semble interagir avec une PAR-polymérase en Co-IP
Merci pour vos conseils
Vav
Je ne suis pas spécialiste mais peut-être que, comme pour les phosphorylations, cette modification post-traductionnelle peut être mise en évidence par un marquage métabolique. Le co-substrat des PARPs est l'ATP. Il est peut-être possible de mettre en évidence la poly-ADP ribosylation de ta protéine purifiée en présence d'une PARP recombinante et d'ATP alpha 32P par autoradiographie.
Merci pour ta réponse. C'est sans doute une bonne idée mais notre labo n'est pas habilité pour la manipulation de radioactivité. Est ce qu'en inhibant les PARP, je peux induire un changement de poids moléculaire de ma protéine? Ce serait déjà une indication...
Sinon il y a la spectrométrie de masse. En effet, un simple changement de migration de ta protéine par l'inhibition des PARP est un maigre renseignement qui est peut-être artéfactuel. Il faut pouvoir le démontrer de façon directe. Déjà la co-IP est un bon début. Maintenant il faut clairement démontrer la poly-ADP ribosylation (PAR) avec spectrométrie de masse ou marquage métabolique. Existe-t-il des anticorps anti-PAR?
re-merci
Même probleme, je n'ai pas accès à la spectro de masse facilement.
Pour répondre à ta question, oui, il existe des anticorps anti-PAR. Je crois qu'il y en a chez cell signaling. Par contre, je ne peux pas diire s'ils sont efficaces car je n'en ai jamais utilisé.
Je crois que c'est la seule solution qui me reste...si on a assez de sous pour l'acheter !
Vav
J'ai connu cette situation dans laquelle on ne peut s'approcher de rien, c'est frustrant!
L'anticorps anti-PAR est une bonne alternative même si cela reste une démonstration indirecte de la PAR de ta protéine. Dans ce cas, je ferais une IP anti-ta protéine suivie d'un western blot anti-PAR pour démontrer qu'elle est PARée.
Comment souhaites-tu inhiber les PARP? Inhibiteur ou siRNA? Dans ce cas, une condition sans inhibiteur/siRNA et une avec inhibiteur/siRNA avec IP anti-ta protéine et western blot anti-PAR et la démonstration sera correcte, je trouve, au niveau fonctionnel. Peut-être que dans les publications cela leur suffit comme manip, mais il serait plus rassurant d'ajouter un marquage métabolique et/ou une spectrométrie de masse dans la mesure du possible (collaboration avec une plate-forme ou un labo intéressé...).
en l'accurence, je pense que ma protéine est PARylée (et non PARée) par une sirtuine c.a.d une PARP dépendante du NAD+(PARP Type III). Dans ce cas, je peux l'activer par des polyphénol type resveratrol / quercétine ou l'inhibée par l'addition de nicotinamide (NAM). Je suis tout à fait d'accord avec ton approche car il est probable qu'en condition basale, je ne pourrais pas voir la PARylation
Un autre probleme vient d'ailleurs de se poser. Il existe deux types de PARP III : celles qui ajoutent un seul adduit ADP-Ribose et celles qui ajoutent un polymére. Par de chance, l'anticorps ne reconnait que les protéines porteuses du polymére et non les protéines mono-Ribosylée. Si c'est la cas de ma protéine, je l'aurais dans ...le baba !
