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Comment lire et interpréter un Immunoblot ?



  1. #1
    Kal-El

    Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Bonsoir à tous,

    Voici un article scientifique. Je l'ai compris parfaitement, seulement, ce que je n'arrive pas c'est à lire et interpréter les résultats, plus précisément à lire et à interpréter les immunoblot. Pouvez-vous m'aidez s'il vous plait ? Comment interpréter tous les immunoblot de la figure 4 ? Merci par avance !


    J'ai mis l'article en "fichier attachés".

    -----

    Images attachées Images attachées

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  3. #2
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Personne ne sait interpréter un immunoblot ?

  4. #3
    Guillaume69

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Soit patient(e). Il faut attendre que les pièces jointes aient été validées, et que quelqu'un les lise.

  5. #4
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Ok, je savais pas. Car chez moi les pièces jointes marchent !
    J'espère qu'ils vérifient le weekend lol

  6. #5
    VilCrocrotte

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    pendant ce temps, je te propose que tu nous en dise un peu plus sur l'immunoblot, sur le principe et des exemples d'applications =D
    VilCrocrotte !! Le super Génie !!

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    piwi

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    J'ai validé.
    Les figures sont dégueulasses.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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  10. #7
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    L'immunoblot ou Western blot est une méthode qui permet la détection et l'identification de protéines spécifiques dans un échantillon biologique.
    Exemple d'applications ? ben comme dans le sujet que j'ai mis en lien ^^ (pour détecter des protéines ubiquitines, c'est à dire des protéines qui marquent les protéines à éliminer, éliminés par les protéasomes situés dans les noyaux et cytosoles des cellules d'ailleurs).

    Par contre, impossible à interpréter ces photos :S

  11. #8
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Merci à toi Piwi !

    regardez la figure 4 : je vois qu'il y a deux expositions : une courte et une longue (explosition aux UV je pense, mais je suis pas sûr). Il y a 5 immunoblot, donc pour 5 cellules différentes (GM038, Hela, A549, etc). Après, j'arrive pas à savoir comment interpréter tout ce joli monde.....

  12. #9
    piwi

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Moi ce que je comprends c'est que l'inhibition de USP1 par SiRNA n'a pas le même effet sur l'ubiquitination de PCNA en fonction du type cellulaire.
    L'exposition longue révèle dans certaines lignées (la seconde par exemple) la présence de formes que l'on ne voit pas pour les temps courts.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  13. #10
    U.N.Owen

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    La figure 4 est très simple, la seule chose que tu dois regarder c'est la présence ou non de bandes supplémentaires quand un inhibiteur du siRNA est ajouté. Apres il ne te reste plus qu'a conclure.

    HS: Tiens on se retrouve autre part que sur C&D VilCrocrotte

  14. #11
    VilCrocrotte

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Citation Envoyé par U.N.Owen Voir le message
    La figure 4 est très simple, la seule chose que tu dois regarder c'est la présence ou non de bandes supplémentaires quand un inhibiteur du siRNA est ajouté. Apres il ne te reste plus qu'a conclure.

    HS: Tiens on se retrouve autre part que sur C&D VilCrocrotte

    Mince alors !! le monde est vraiment petit mais normalement internet est vastes bah oui, moi aussi je viens mettre mon nez dans le domaine de la biologie et moi aussi j'aime bien C&D une bonne source de connaissance ^^
    Aidez les gens dans le besoin est toujours enrichissant pour les 2 parties ;-D
    VilCrocrotte !! Le super Génie !!

  15. #12
    gorben

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    J'ai validé.
    Les figures sont dégueulasses.
    Ca me rappelle mes partiels de BM en maitrise. Je ne comprend pas pourquoi pour les etudiants, les profs ne mettent pas des blots clairs. Je me souviens qu'a l'epoque j'etais reste 20min a regarder des patates noires sans rien pouvoir conclure...

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  17. #13
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Tout d'abord, merci à vous tous pour vos réponses

    Ensuite, j'essai de comprendre les photos dans leur intégralité : Pourquoi faire une exposition longue puis une courte ? Quelle est l'intérêt ? Ensuite, à quoi correspond les Ub(3)-PCNA ; Ub(2)-PCNA, le "siRNA control", bref, toutes ces annotations ? car je me mélange un peu les pinceaux !
    Et comment interpréter les bandes (ou plutôt tâches, désolé pour la qualité !) ? Par rapport à leur "épaisseur", ou leur longueur ? Et si c'est plus long, c'est parce que l'ubiquitition a "marché" sur ces protéines ?

  18. #14
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Personne ?

    Si je prend par exemple dans la figure 4, l'immunoblot D, qu'est-ce que je dois en conclure ? Comme les tâches sont étendues et larges, l'invalidation de USP1 sur l'ubiquitination de PCNA est plus forte dans cette cellule que dans celle présenté en B (où là les tâches sont un peu plus petites) ?

    Est-ce ça ou suis-je HS ?

  19. #15
    U.N.Owen

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    - Ensuite, j'essai de comprendre les photos dans leur intégralité : Pourquoi faire une exposition longue puis une courte ?

    La différence d'exposition permet de voir si de nouvelles bandes apparaissent. Par exemple, tu peux voir sur le temps d'exposition long des bandes qui sont invisibles sur le temps d'exposition court (car la quantité de protéines correspondant a cette bande est faible, voir figure 4 gel E).


    - Quelle est l'intérêt ? Ensuite, à quoi correspond les Ub(3)-PCNA ; Ub(2)-PCNA, le "siRNA control", bref, toutes ces annotations ? car je me mélange un peu les pinceaux !

    Les Ub(1), (2) et (3) correspondent aux niveaux d'ubiquitination de la protéine.
    Le siRNA control correspond a l'utilisation d'un siRNA quelconque comme témoin. Ca permet entre autre de pouvoir faire une comparaison avec les résultats obtenus en présence du siRNA inhibant USP1.


    - Et comment interpréter les bandes (ou plutôt tâches, désolé pour la qualité !) ? Par rapport à leur "épaisseur", ou leur longueur ? Et si c'est plus long, c'est parce que l'ubiquitition a "marché" sur ces protéines ?

    Tu dois regarder l'intensité des bandes (même si ce n'est pas aisé vu la qualité des figures...). Ce qu'il faut regarder ce sont les taux d'ubiquitination de PCNA dans les différentes cellules et mettre ça en rapport avec l'inactivation de USP1.

  20. #16
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Tout d'abord, un grand merci de bien vouloir m'aider, c'est super sympa !

    Alors si j'ai bien tout compris : les exposition longue durée nous donnent plus de renseignements que les courtes durée, donc étudier les courtes durées sert un peu "à rien", dans le sens ou les longues durées nous en apprenent plus.

    Donc si j'ai bien compris, les protéines en B sont plus ubiquitinés que les protéines en A par exemple, car les tâches sopnt certes un peu moins intenses (qualité vraiment pourri) mais nous avons plus de bandes, donc l'invalidation de USP1 se fait plus ressentir en B qu'en A.

    De plus, dans les 5 gels, les résultats obtenus avec le siRNA qui inhibe USP1 montrent que ces petits ARN double brins sont plus efficaces dans l'invalidation de USP1 que les siRNA de control.

    Ici j'ai décrit les immuniblot et fait part des résultats.

    Conclusion que l'on peut donner sur cette figure 4 (je ne parle que de la figure 4 car je ne dois travailler que sur celle-ci. Donc j'essaie de comprendre celle-là en priorité, les autres après ça ria mieux).

    Conclusion donc -> Nous pouvons dire que les effets d'invalidation de USP1 par les ARN double brins siRNA sont fonctions du type de cellule.

    Ais-je tout bon ?

    Enfin, à quoi sert alors l'indication à la fin "on utilise des anticoprs anti-PCNA" ?

    Encore merci

  21. #17
    U.N.Owen

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    - Alors si j'ai bien tout compris : les exposition longue durée nous donnent plus de renseignements que les courtes durée, donc étudier les courtes durées sert un peu "à rien", dans le sens ou les longues durées nous en apprenent plus.

    Non, ne serait-ce que sur cette figure l'exposition courte permet de mieux voir certaines bandes car on ne peut plus différencier certaines de ces dernières sur l'exposition longue (le gel D en est un bon exemple).


    - Donc si j'ai bien compris, les protéines en B sont plus ubiquitinés que les protéines en A par exemple, car les tâches sopnt certes un peu moins intenses (qualité vraiment pourri) mais nous avons plus de bandes, donc l'invalidation de USP1 se fait plus ressentir en B qu'en A.

    Ok, par contre je ne pense pas qu'on puisse dire que les bandes sont moins intenses en B qu'en A, déjà parce que la qualité est trop mauvaise pour faire une quelconque analyse quantitative et surtout parce que les bandes correspondant a l'actine diffèrent trop entre A et B et qu'il faut donc normaliser tout ça avant de pouvoir faire une quantification.


    - De plus, dans les 5 gels, les résultats obtenus avec le siRNA qui inhibe USP1 montrent que ces petits ARN double brins sont plus efficaces dans l'invalidation de USP1 que les siRNA de control.

    Ce qui est normal car le siRNA control n'inhibe pas USP1 (vu que c'est justement un contrôle).


    - Conclusion donc -> Nous pouvons dire que les effets d'invalidation de USP1 par les ARN double brins siRNA sont fonctions du type de cellule.

    Pour moi tu n'as qu'une partie de la réponse. Il y a aussi un lien entre USP1, l'ubiquitination et les kinases (après je ne sais pas si c'est toi qui t'en occupes).


    - Enfin, à quoi sert alors l'indication à la fin "on utilise des anticoprs anti-PCNA" ?

    Les expériences de cette figure sont des immunoblots, donc les anticorps anti-PCNA permette de repérer plus ou moins spécifiquement PCNA dans l'ensemble des protéines.

  22. #18
    piwi

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    En fait, on utilise des Ig@PCNA pour pouvoir observer les formes ubiquitinylées qui shiftent par rapport à la forme "native". Le problème c'est que dans leur cellules, il y a une tonne de PCNA "natif" par rapport aux formes ubiquitinylées. Du coup il y a des petites bandes shiftées au dessus et une énorme patate native en bas. Et c'est ça qui pose un problème dans l'obtention des données.

    Soit vous faites une expo longue et vous faites apparaitre certaines formes shiftées peu présentent, mais en même temps vous saturez le signal de la forme native qui masquent certaines choses.
    Soit vous faites une expo courte et vous ne voyez pas toutes les formes shiftées mais vous avec un signal natif moins important et vous pouvez voir certaines autres formes shiftées qui étaient sous le signal natif dans l'expo longue.

    Donc les deux expos sont utiles.

    Alors, pourquoi ne pas utiliser un Ig@ubiquitine? Simplement, parce que vous verriez les bandes shiftées de PCNA mais vous ne sauriez pas dire de quelle protéine il s'agit. Or ce que vous voulez affirmer c'est qu'il s'agit de PCNA ubiquitinylé. Maintenant, la question que je me pose (mais vous devez avoir la réponse dans un coin ou même peut être dans la légende que je n'ai pas lu) c'est pourquoi il y a autant de PCNA dans leurs extraits et à priori dans leurs cellules?

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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  24. #19
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Ok, donc on peut dire que les expositions courtes sont un peu des "zooms" sur la partie inférieure des longues !

    Quelle sont les bandes d'actines ?

    Concernant les Kinases, je penses pas que ce soit moi, car cela est traité dans les autres figures....De plus, ces figures ne permettent pas de dire le rôle des kinases, non ? J'ai beau regarder, comment savoir si les kinases ici régulent l'ubiquitination de PCNA ? Avec ces immunoblot, nous savons juste que siRNA régule l'ubiquitination par rapport aux différnetes cellules.

  25. #20
    piwi

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    L'actine est, bien entendu, une protéine ubiquitaire dont on estime que les différents traitements appliqués aux cellules ne vont pas modifier la concentration. Ainsi, on s'en sert pour certifier que l'on a bien déposer la même quantité globale de protéine dans les deux puits (contrôle et expérimental).
    Imaginons que j'ai la grosse patate de PCNA partout et deux fois moins d'une forme ubiquitinylée. Comment conclure?
    J'ai deux fois moins de formes ubiquitinylée? En fait, je ne peux rien dire parce que la patate PCNA est tellement énorme qu'il pourrait y avoir deux fois moins de protéines et j'aurais pourtant toujours le même signal. Rien qu'à regarder les blots, je ne peux pas dire si il y a deux fois moins de protéines dans une ligne par rapport à l'autre ou si mon traitement à un effet. Pour palier à ce doute, on révèle une protéine de référence qui permet d'affirmer qu'il y a bien autant de protéine dans un dépot que dans l'autre. Cette protéine ici, c'est l'actine.

    Concernant, la figure 4, il ne me semble pas que vous puissiez conclure quoi que ce soit quant au rôle d'ATR et ATM ici. (je n'ai pas re-regardé la figure)
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  26. #21
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Merci Piwi de ces informations fort utiles ! Je ne voyais pas les choses comme ça par rapport aux expositions longues et courtes. En complètant Owen, ça me donne beaucoup d'infos, merci !

    Concernant la quantité de PCNA j'avoue que là aussi je ne sais pas. Nous savons juste par l'énoncé que c'est une protéine chez l'humain qui est ubiquitiné quand il y a un stress. Peut-être que ces cellules contiennent naturellement autant de PCNA....car je ne pense pas qu'ils en ait rajouté dans les cellules.

  27. #22
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    En effet. Si je ne me base que sur la figure 4, ATM et ATR sont "absents", et aucunes infos ne sont données sur eux. La figure 3 en parle, mais je n'ai pas l'impression que ces kinases ait un rapport avec la fin de l'article.

    Par contre, dans la conclusion général, nous allons devoir faire la synthèse et reliés toutes ces informations. Mais à partir du moment où on a tous compris nos figures, ça ne sera pas difficiles de mettre les informations en relations !

  28. #23
    U.N.Owen

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Les bandes d'actine ont un rôle de témoin. Par exemple, pour pouvoir comparer les deux conditions dans le gel A il faut que les deux bandes d'actine est la même intensité (ce qui veut dire que les quantités de protéines sont a peu près égales entre les deux conditions).

    Pour les kinases, il semblerait que l'article n'en parle que dans l'introduction et que les figures correspondantes ont été enlevées donc j'ai lu un peu trop vite.

    Par contre, le siRNA a été ajoute pour le besoin de l'expérience, ce n'est pas lui qui régule directement l'ubiquitination de PNCA.

  29. #24
    piwi

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    cellules contiennent naturellement autant de PCNA
    Non en fait, ce qu'il faut penser c'est qu'ils ont du charger comme des malades pour faire apparaitre leurs bandes ubiquitinylées qui ne doivent pas représenter grand chose in vivo. Du coup, on peut se demander, à la simple vue de la figure, quel est le sens biologique à donner à tout cela. Quand on sature un gel comme ils l'ont fait, on peut faire apparaitre un peu tout et n'importe quoi.
    A vous de voir si le reste des figures soutiennent ce résultat. Sinon, c'est peut être une critique à émettre en fin d'exposé, si on vous demande d'en émettre une.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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  31. #25
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Owen, si j'ai bien saisis, le siRNA annule les effets de USP1 sur l'ubiquitination de PCNA, donc elles régulent plutôt la désubiquitination, non ? L'ubiquitination étant alors régulé, je pense, par les kinases (mais ça je ne peux pas le vérifier, mais c'est l'hypothèse).

    @ Piwi : en simplifié, ce serait donc pour "mieux voir" ?

  32. #26
    U.N.Owen

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    - Owen, si j'ai bien saisis, le siRNA annule les effets de USP1 sur l'ubiquitination de PCNA, donc elles régulent plutôt la désubiquitination, non ? L'ubiquitination étant alors régulé, je pense, par les kinases (mais ça je ne peux pas le vérifier, mais c'est l'hypothèse).

    C'est ça, USP1 permet la désubiquitination de PCNA, donc si on inhibe USP1 avec un siRNA, l'ubiquitination de PCNA peut alors se faire.
    Pour le rôle des kinases, on ne peut pas savoir vu qu'il n'y a pas de réelles informations dans l'introduction.

  33. #27
    Kal-El

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Ok !

    Bon, grâce à vous tous, j'ai compris et arrive à lire les immunoblots ! Encore un grand merci à tous ! Je pense avoir fait le tour des figures et savoir tout ce que je pouvais savoir de ces expériences.
    Encore merci, et bonne soirée à vous tous !

  34. #28
    abouss

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    selon moi
    actin : c'est le témoin de charge qui permet d'estimer l'intensité de chaque bande et d'évaluer le niveau d'expression de chaque proteine
    siARN control : c'est un ARN interférent non spécifique de la proteine PCNA , permet d'être sure de la spécificité du siARN USP1 qui est spécifique du PCNA
    en présence du siRNA UPS1 on a des bandes beaucoup plus sombres qui correspondent aux proteines PCNA ubiquitinilés , et dans la conditions control ,on a une faibles ubuiquitinations des PCNA
    conclusion: l'invalidation de USP1 inhibe l'ubiquitination de PCNA , c'est la conclusion a tirer je pense , après pour rajouter je pense qu'après une short expo, on a une faible densité de pCNA native contrairement a une longue exposition

  35. #29
    Cendres

    Re : Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

    Bonjour abouss et merci, mais je pense que plus de sept ans après, la personne est déjà passée à autre chose.
    N'a de convictions que celui qui n'a rien approfondi (Cioran)

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