Amplification par PCR

[invite19cd4fad]

Coucou J'ai une ambiguïté que j'espère vous m'aider à la soulever . Voila , j'ai amplifier par PCR un gène de 510 pb , mes amorces Forword et Reverse ont déja été testé (et elles sont intactes). J'ai fait migrer le produit de PCR sur gel d'agarose 2% (avec BET) , le tampon de migration est le TAE. Jusque-là tout parait normal. Le problème lors de la visualisation sous UV ,je voit la bande de 510 pb , mais aussi une autre bande de 120 pb !!!!! C'est une amplification non spécifique sachant qu'elle n'apparait pas dans le témoin négatif (donc c'est pas une contamination). J'ai lancer une autre culture , j'ai refait tous mes produits , j'ai essayer d'augmenter la température du thermocycleur, j'ai jouer sur le volume d'ADN dans le Mix PCR mais TJR mem résultat SOS SVP
-----

[invite5bada88f]

Bonjour, manifestement il s'agit d'hybridation non spécifique comme vous l'avez dit. Je pense que c'est caractéristique des amorces mises en excès et de petites tailles qui forment des polymères entre elles. Elles migrent donc plus vite ( petites tailles) .

Cordialement.

[invitec9f0f895]

salut

J'ai du mal a comprendre ce qui te gene! la bande a 510nt est celle que tu veux, a partir du moment ou tu l'as ou est le probleme?
Si tu veux te debarasser da la bande supplémentaire, tu n'as qu'a la purifier.

YOyo

[invite853321bf]

Tu peux aussi augmenter ta concentration en MgCl2, mais je suis d'accord avec les autres. A moins que tes amorces viennent d'une publi où cette amplification aspécifique n'était pas indiquée, ce n'est pas un gros problème.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite19cd4fad]

salut

J'ai du mal a comprendre ce qui te gene! la bande a 510nt est celle que tu veux, a partir du moment ou tu l'as ou est le probleme?
Si tu veux te debarasser da la bande supplémentaire, tu n'as qu'a la purifier.

YOyo

@ YOYO : Je veux cloner ce gène de 510 pb , donc je veut l'avoir pur . Mais vous m'avez dit que je peu le purifier , comment ca SVP ?

[invite19cd4fad]

Tu peux aussi augmenter ta concentration en MgCl2, mais je suis d'accord avec les autres. A moins que tes amorces viennent d'une publi où cette amplification aspécifique n'était pas indiquée, ce n'est pas un gros problème.

D accord je vais voir si l'augmentation de la concentration en MgCl2 peut résoudre le problème ; car moi je veut avoir un gène pur dans le but de le cloner . Merci

[invite19cd4fad]

Bonjour, manifestement il s'agit d'hybridation non spécifique comme vous l'avez dit. Je pense que c'est caractéristique des amorces mises en excès et de petites tailles qui forment des polymères entre elles. Elles migrent donc plus vite ( petites tailles) .

Cordialement.

Vous voulez dire la diminution de la concentration des amorces peut résoudre ce problème ?

[invite5bada88f]

Non! au contraire l'excès d'amorces favorise leurs hybridations, donc une diminution de la concentration renderait la PCR inéfficace...

[invite853321bf]

Non! au contraire l'excès d'amorces favorise leurs hybridations, donc une diminution de la concentration renderait la PCR inéfficace...

Oui et non. Trop peut aussi favoriser la fixation des amorces sur des zones non spécifiques, pouvant expliquer cette bande de 100pb. Les amorces sont de toute façon toujours en excès (La réaction perd de son efficacité au fil des cycles, autant que ce ne soit pas pour un truc aussi bête que ça) mais il convient de tester différentes concentrations pour être sur de ne pas avoir ce type de problèmes.
@mammoul : augmenter la concentration de MgCl2 peut, mais c'est pas une solution miracle pour éliminer toute ampli aspécifique. à tester, comme la concentration de MgCl2 mais ça multiplie les tests
C'est une relation complexe entre la concentration en MgCl2, d'amorces et la température d'annealing. Ca requiert plus de tests que d'utilisation de règles bien établies.

Tu peux aussi purifier la bande à partir du gel, il existe des kits le permettant : faut découper le gel à partir de la photo prise pour situer sa bande puis on élue l'ADN avec des colonnes comme pour une extraction d'ADN à partir de cellules.