Gateway technology

[invitee6ff25aa]

Hello everyone,

I'm new in this forum.
So here is my question: I want to use the gateway cloning technology. I have received from another lab an entry vector and a destination vector. To build my entry vector containing my sequence of interest, could I use the entry vector I received and put directly my PCR product in it? Or I have to make first a BP reaction with a donor vector to obtain a new entry with my sequence of interest??
Thanks a lot for your answer, I'm not a specailist of cloning...
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[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Le forum est francophone. Je te demande donc de reformuler ton message en Français. Si ce n'est pas le cas, la discussion sera supprimée.

LXR pour la modération

[invitee6ff25aa]

Ah désolé... C'est sûr ce sera plus facile. Pardon!

Je débute en clonage, et je vais utiliser le système Gateway. J'ai reçu d'un labo un entry vector et un destination vector. J'ai regardé un peu le système Gateway, et ce n'est pas clair pour moi.
Comment je fais pour rentrer un gène d'intérêt (produit de PCR) dans mon entry vector? Est ce que je suis obligée de créer des bouts attB en 5' et 3' de mon produit de PCR, faire une réaction BP avec un vecteur donneur (dans ce cas lequel?) afin d'obtenir à l'issue de la réaction mon plasmide Entry recombiné avec mon gène d'intérêt. Ou bien puis-je utiliser un vecteur ENTRY vide que j'ai et recombiner directement mon produit de PCR dedans?

Merci beaucoup de vos réponses.

[invite6d6b7805]

Salut,

Je débute aussi avec le gateway, enfin le clonage tout court.

Tout ce que je peux te dire et ça t'amènera à l'étape suivante, c'est que tu dois absolument avoir tes extrémités 3' et 5' flanquées d'une séquence attb

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee6ff25aa]

Ben pas forcément de ce que je comprend.
Si je flanque mon produit de PCR avec des sites attB, là je suis obligée de le recombiner avec un vecteur pDONOR, par contre je peux générer des fragments reconnus par des enzymes de restriction et cloner directement dans un vecteur pENTR, ou encore utiliser un pENTR-TOPO il me semble...

[inviteb8ce6858]

Salut,
Je tombe sur cette discussion 3 ans après mais la je suis dans la meme situation. Avez vous pu réussir votre clonage? En effet je dispose d'un système gateway et j'ai des fragments pcr que j'ai envie d'insérer dans mon vecteur d'entrée pENTR1A, mais la carte de ce vecteur est un peu ambigue pour moi.
Quelqu'un peut-il m'aider?