GFP bleaching

[invite69704257]

Bonjour tout le monde,

Je voudrais faire un immunomarquage sur des coupes de cerveau provenant d'une souris exprimant deja une proteine taguee GFP. Le probleme est que je n'ai pas beaucoup de cannaux sur mon microscope et je vaudrais donc bleacher ma GFP pour faire un double marquage utilisant un flurochrome vert (type FITC ou Alexa 488) et un rouge.

J'ai essaye de laisse mes coupes a la lumiere bleue qui excite normalement ma GFP (pendant 2h), j'ai egaleemnt tente les UV mais rien ne fonctionne. Est ce que quelqu'un pourrai me depanner?

Merci d'avance!
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[inviteb3a6feac]

Bonjour

Je ne saisis pas votre problème.
Pourquoi voulez vous bleacher votre gfp ?
il est certain que 2h d'excitation va déglinguer votre GFP...

Et pourquoi faire le comarquage, on peut trouver d'autres solutions peut etre?

[gorben]

Bizarre qu'il te reste encore de la GFP apres 2h... tu es sur que c'est bien la GFP et non une contamination que tu vois? Il y a pas mal de choses qui emettent dans le meme spectre et qui sont bien plus resistant au bleaching. Pour info, la GFP dans mes conditions a une demi-vie ~ 5-10 secondes...
Je pense que tu dois pouvoir trouver des produits pour "tuer" ton fluorophore (regarde chez invitrogen). Mais honnetement, 2h et pas de difference de signal, je commencerais par chercher mon contaminant

A+

[invite69704257]

En fait pour etre plus complet, j'utilise une toxine pour tuer mes neurones infectes avec un virus coexprimant un recepteur a cette toxine et la GFP (humanized R. reniformis GFP pour etre precis). Le probleme est qu'apres injection de la toxine, je vois toujours des neurones GFP positifs (ce qui indique qu'ils ne sont pas morts). Je voudrait cependant voir s'il y a de la mort neuronale (par apoptose) et donc souhaiterais faire un marquage TUNNEL. Nous avons un Kit au labo marque au FITC. C'est pour cela que je voulais bleacher la GFP.

Je suis moi meme tres etonne de voir cette GFP resister a ce point, mais j'exclue la possibilite du contaminant. En effet je vois clairement le marquage de mes neurones (forme bien reconnaissable) ainsi que les projections de ceux-ci...

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb3a6feac]

AH d'accord !!!

Mais alors pourquoi ne pas simplement faire un marquage TUNEL couplé à autre chose que le FITC ? radioactivité, CY 3 ?...

Ou alors je viens de penser... Pouvez vous faire un KO de votre proétine taguée GFP, ou un silencing ?

[invite69704257]

En fait on avait le kit couple FITC au labo et c'etait plus simple d'utiliser celui ci plutot que d'en recommander un autre.
Je ne pensais pas que bleacher la GFP serait un probleme quelle erreur!
Je pense que je vais en effet acheter un kit marque au CY3.

[invite28e24fd5]

Bonjour,
J'avais le même problème que vous, et comme je viens de trouver un protocole qui marche je partage

http://www.excli.de/vol8/prachayasit...eous_proof.pdf

Pour mes lames (pancréas de souris) j'ai utilisé la solution suivante : Cu2+ (50µM) + Acide ascorbique (10mM) + H2O2 (1%), 10 min d'incubation.

Je peux vous envoyer les photos avant/après si ça vous intéresse toujours.

Bonne journée !