Sequencage supplémentaire de quelques centaines de bases

[invite8f53b8ba]

Bonjour a vous!

Je suis devant un problème pour mon stage de master.

Voici le cas:
J'ai réussi a séquencer une partie d'un gène a l'aide de primers dégénérés.
L'objectif de la manip est de trouver une mutation ponctuelle présente chez d'autres éspèces.
Cette mutation, qui induit une résistance, est présente a différentes positions ( par contre toujours sur le me domaine du meme gène).

Je n'ai malheureusement pas réussi a séquencer tout le domaine avec mes primers dégénérés et n'ai donc pas pu comparer tous les sites de mutations possibles.

Ma question est donc la suivante:

Connaitriez-vous une technique permettant de séquencer quelques centaines de bases en amont de ma séquence déjà connue sans utiliser des primers dégénérées? (j'ai pensé a de la marche sur l'ADN (type seegene DNA walking kit) mais ca ne rentre pas dans mon budget!)

Toute aide est la bienvenue!
-----

[Flyingbike]

ben une fois que tu as ta séquence, tu peux designer des primers spécifiques pour aller un peu plus loin, non ?

[invite1c25428c]

Question con réponse con... Non je rigole il n'y a pas de question bête! Comme dit précédemment tu prends une amorce au début de la séquence déjà connue mais dans l'autre sens.

[invite8f53b8ba]

oui ca j'ai déjà des primers spécifiques (du moins des primers spécifiqes sens) mais ils ne marchent pas avec mon primer anti-sens dégénéré. Je n'ai aucun produit et je ne peux pas designer un nouveau reverse dégénéré car la region qui suit est très peu conservée entre les especes.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite1c25428c]

Nan mais si tu as séquensé dans un sens tu connais maintenant la séquence donc tu peux faire synthétiser une amorce qui te permettra de séquencer dans l'autre sens et donc en amont de tes premières amorces dégénérées.

[Yoyo]

Salut

Ca va pas etre simple sauf si ton gene en question est cloné dans un plasmide, sinon tu n'en n'auras jamais assez pour pouvoir le séquencer comme tu l'expliques.

une solution s'il n'est pas cloné, c'est de digérer ton ADNg par une enzyme qui ne coupe pas dans le fragment deja séquencé. Puis tu religatures les fragments sur eux meme pour avoir des molécules circulaires. Ainsi tu peux réaliser une amplification par PCR a partir de deux oligos en sens opposé situés dans la séquence deja clonée. Tu obtiens un fragment linéaire qu'il ne te reste plus qu'a séquencer facilement une fois cloné dans un pUC ou un bluescript.
comme tu connais le site de coupure initiale tu peux facilement identifier les régions qui sont en 5' et celles en 3'.

Yoyo