Design de primer pour qRT-PCR sybr green

[invite84ba569f]

Bonjour,
Je veux designer des primers pour la tubuline Tub1c, cependant pour satisfaire les différents critères (Tm, taille de l'amplicon...) je me retrouve avec un des 2 primers (forward ou reverse) qui reconnait un autre isoforme de tubuline. Sachant que l'autre primer reconnait de façon spécifique la tuba1c, est-ce que je peux utiliser ce couple de primers ?
Autre question, la taille des primers et de 18pb pour le forward et 16pb pour le reverse, est-ce suffisant ou faut-il qu'ils soient plus long que ça.

Merci pour votre aide
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[invite2fb83916]

Hello!

Comment as-tu designé tes primers? Personnellement, j'utilise primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)
Tu mets la séquence de ton isoforme et tu choisis la librairie HUMAN, il devrait te proposer uniquement les primers spécifiques à ton isoforme. De plus, tu peux choisir la taille de tes primers, choisir de mettre des GC clamps ou non, ...

Bonne soirée!

[invite84ba569f]

Hello!

Comment as-tu designé tes primers? Personnellement, j'utilise primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)
Tu mets la séquence de ton isoforme et tu choisis la librairie HUMAN, il devrait te proposer uniquement les primers spécifiques à ton isoforme. De plus, tu peux choisir la taille de tes primers, choisir de mettre des GC clamps ou non, ...

Bonne soirée!

J'utilise primer3plus, ensuite je fais un blast pour les primers obtenus, malheureusement tout les couples de primers obtenus marchent également avec les autres isoformes. Je viens de regarder pour primer3, c'est pareil que primer3plus...

[invite853321bf]

Perso quand je designe des amorces, je fais d'abord un alignement de séquences, avec des séquences de ce que je veux amplifier et des séquences suceptibles de se trouver en compétition dans mon échantillon, et je cherche des zones avec des séquences différentes.
Ensuite je restreins la zone de recherche de primers à cette zone en espérant que les primers tombent sur la zone intéressante.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

La fusion de tout cela: primerblast (NCBI).
Vous entrez la référence NI de votre gène, vous choisissez la taille de l'amplicon (entre 100 et 300 pb), vous cochez l'option "les primers sont séparés par au moins un exon" (très important pour la qPCR). Vous choisissez l'organisme et c'est parti. Le programme cherche la séquence et repère les exons et les introns, envoie le transcrit dans primer3. Les paires sont ensuite blastées contre l'espèce spécifiée. Finalement, le programme vous renvoie les paires spécifiques, il n'y a plus qu'à commander.

^_^

Cordialement,
piwi