Bonjour,
j'ai des problèmes avec une PCR suivie d'une restriction avec RsaI. Alors que j'ai des produits d'amplification après la PCR, je ne vois plus rien sur mon gel après la restriction. Je ne comprend pas comment l'action de RSAI pourrait complètement dégrader mes ADNs au point que je ne vois plus rien sur mon gel. Je n'arrive pas à résoudre ce problème donc tous les conseils seront les bienvenus.
Merci
Bonjour,
En me renseignant sur cette enzyme sur : http://www.roche-applied-science.com...t/0729124a.pdf
J'ai tout d'abord bêtement envi de dire est-ce qu'il n'y a pas d'autres sites et vu qu'elle est isoschizomère avec Afa 1 et Csp 61, y-a t'il présence de ces sites également? Donc une première solution serait de changer d'enzyme si cela est possible...
Faut pas s'étonner, RsaI reconnait des palindromes de 4. Si tu connais ta séquence, tu peux vérifier le nombre de sites de restriction mais il doit y en avoir pas mal. Ca peut expliquer pourquoi tu ne vois rien.
Faudrait nous dire quelle est ta séquence et quel type de gel tu utilises.
Tout d'abord, merci pour vos réponses,
je dois préciser que ce protocole (>PCR+ restriction RsaI, migration sur gel à 4%) à toujours fonctionner dans notre labo jusqu'à il y a 6 mois. Ce protocole à était mis en place pour génotyper des lignées d'animaux transgéniques.
Tout d'un coup, sans changement apparent des réactifs, les chercheurs précédents n'ont plus obtenu de résultats et je dois identifier le problème et le résoudre.
Je vais essayer d'obtenir la séquence génomique en question pour vérifier s'il n'y a pas d'autres sites de coupure comme vous me l'avez conseillé mais si c'était le cas je devrait voir plus de bandes et non pas aucune, n'est ce pas?
Toutes les hypothèses sont les bienvenues.
Merci
