précipitation de l'ADN diminution de la taille de mon fragment!!!

[invitec89008af]

bonjour à tous.
j'ai vraiment un gros problème et c'est la première fois que ça m'arrive.
je digère un vecteur d'environ 6000pb avec une enzyme de restriction qui "coupe" une seule fois dans ce vecteur. je vérifie ma digestion sur gel d'agarose...une belle bande à 6000pb. je décide de précipiter (avec de l'éthanol) l'ADN sur la nuit. le lendemain, je re-dépose sur gel....et là....il y'a une bande....mais à ...2000pb!!!!
je ne comprend pas, est ce que ça vous ait déjà arrivé? avez vous une explication?!
-----

[side311]

Bonjour,

effectivement c'est bizarre.

Je vois que deux solution. Lors de ta purifiaction ton ADN à été maltraité et à été coupé à 2000pb et le reste est partie à la poubelle.

Ou bien présence suspecté de DNAse durant la purif...

Aucune autre théorie.

A part une.... tu t'es TROMPER de tube?

[invite24375423]

Salut,

Serait-il possible que ton endonucléase de restriction ait une activité qui puisse être modifiée en présence de fortes teneurs en éthanol (admettons une gène sur le site de reconnaissance) entraînant un mésappariement et la catalyse d'une coupure non spécifique?

Je sais que sur un ADN séché à l'éthanol une activité protéique puisse sembler improbable, mais sait-on jamais, de l'eau résiduelle pourrait rester?

[invitec89008af]

j'ai refait la manip avec des produits neufs (de peur d'une contamination) et j'ai le même résultat!
encore plus étrange, je coupe ma bande de 2000pb je la rentre dans un vecteur pGEM-T et je fais des PCR avec les amorces T7 et SP6 qui encadrent le site de clonage. et là j'ai des bandes à 1000pb!!!
j'envoie à séquencer et qu'est ce que j'ai...rien, et même moins que rien car il semble que près de 300pb du vecteur pGEM-T ont disparu!!!!
je n'y comprend rien.

[A voir en vidéo sur Futura]

[kamor]

Tu as fait migré selon les mêmes conditions les 2 fois, avec le même marqueur de taille ?

[invitec89008af]

oui bien sur tous dans le même conditions

[kamor]

Donc pour tout résumer :
tu as un vecteur de 6kb que tu as ouvert. A ce moment, ton gel te confirme sa taille de 6 kb. Après une nuit dans de l'éthanol, ce même plasmide ne fait plus que 2kb. Tu récupères ce fragment, tu l'intègres dans un autre vecteur, puis tu fais une PCR sur ce fragment, et là 1kb.
J'ai oublié un truc ?
Euh là à part quelqu'un de ton équipe qui te fait une (très mauvaise) blague, je comprends pas...

[Flyingbike]

tu n'as pas de la "star-activity" avec tes enzymes de restriction ?