distribution de la taille de fragment d'ADN pour un échantillon de petite quantité

[invite420decec]

Bonjour,

Je recherche un protocole ou une méthode permettant de visualiser la taille de fragment d'adn pour un extrait d'ADN de très faible concentration (eg. 1pg-1ng).

Je vous remercie d'avance

Baxy
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[Flyingbike]

je n'ai pas d'idée précise mais j'imagine qu'il doit être possible de l'estimer à partir de courbes de fusion (Tm proportionnel à la longueur, à %GC constant)

[invite420decec]

Oui effectivement le Tm est un indicateur de la taille. Mais mon soucis est que je vais me retrouver avec une population comprenant des tailles de fragments différentes. Et ce que je recherche c'est d'identifier la taille de chacun des fragments, mais également la proportion de chaque groupe de fragment.

[kamor]

Le Tm est dépendant de la taille du fragment jusqu'à une certaine longueur, de l'ordre d'une quarantaine de pb si mes souvenirs sont bons. Ensuite c'est plus le % G-C qui prime (Sinon il faudrait les t° du soleil pour dénaturer un brin complet ).
Le s à fragment dans ton titre et tes premiers messages auraient permis d'être plus précis, le fait qu'ils soient nombreux changent le problème
Je réaliserai une PCR avec des amorces aléatoires courtes pour pouvoir amplifier tous tes fragments et ensuite faire une électrophorèse puis mesurer la fluorescence du BET pour chaque bande.
Les problèmes seront :
- les amorces. Comment être sur de pouvoir amplifier tous tes fragments.
- la définition du gel = une bande pourrait correspondre à plusieurs fragments sans qu'il soit possible de les différencier.

Peut être (surement) y a t'il des méthodes plus simples à base de HPLC ou CPG mais ce sont des domaines où je me contente de la théorie

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

je n'y crois pas trop, sans vouloir te vexer

une pcr n'aura pas un rendement identique sur tous les fragments, coment choisir la température et les amorces ?

je suis d'accord avec toi pour dire qu'il y a surement des méthodes basées sur d'autres technologies, mais peut être pas abordables.

baxy tu peux nous en dire plus sur ces fragments (origine, ordre d'idée de taille...)

[kamor]

Non ça me vexe pas du tout c'est vrai, c'était des points que je n'avais pas abordé.
Enfin il y en a plein qui rendrait cette manip hasardeuse.