Enzymes de restriction VS fragment d'ADN

[invite12cad8f0]

Bonjour

J'ai une petite question concernant le mode de fonctionnement d'une enzyme de restriction lors de la digestion d'un fragment d'ADN :

Combien de paires de bases nécessite une enzyme de restriction de part et d'autre de son site de reconnaissance afin qu'elle puisse opérer la coupure du fragment dans les meilleures conditions ?

Explication : après avoir amplifié mon insert par PCR, je le digère d'un côté avec une enzyme qui donne des extrémités cohésives (BglII pour ne pas la citer). Seulement, le site de reconnaissance est lui-même à l'extrémité de mon insert (car je l'ai ajouté artificiellement grâce à mes primers), si bien que le site n'est flanqué que de 2 paires de bases seulement d'un côté, et de tout le reste de mon insert de l'autre.

Comme je m'y attendais, l'insert ne s'est pas intégré dans mon vecteur , et je voudrais savoir si le poblème pouvait venir de là.


Merci d'avance
Cordialement
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[invite77479dce]

Bonjour,
Je pense que deux paires de bases c'est peut-être insuffisant pour permettre la digestion. j'avais l'ahabitude de mettre 4 à 5 base en amont de mon site de restriction, donnant un design d'amorce de ce genre :
TATTA - site de restriction - amorce
Voilà. l'idéal, si tu peux te le permettre, c'est avoir des sites de restriction différents sur tes amorces sens et antisens, comme ça lorsque tu fais ta ligation, pas de fermeture du vecteur sans insert, et pas df'insert dans le mauvais sens. (Je pense que ton vecteur possède un polylinker !)
Bon courage

[invite12cad8f0]

Bonjour

Merci pour ta réponse.
J'ai effectivement coupé l'autre extrémité de mon insert avec une autre enzyme pour m'affranchir de toutes les étapes de phosphorylation / déphosphorylation. Et encore, ma ligase a des propriétés de polymérase et est capable de "réparer" l'ADN avant la ligation, si bien qu'elle peut quand même lier deux extremités cohésives différentes.

Mais de toute façon, je me rends compte que la situation est semblable de l'autre côté .
Je vais donc essayer avec d'autres primers, qui laisseront un peu plus de bases à l'extrémité.

Merci

[invite1db95efe]

Bonjour, j'aurais une question de novice sur les enzymes de restriction : En quoi le fait d'être un site palindromique du style ATAT rend une séquence vulnérable aux enzymes de restriction?

Ce que je veux dire c'est que je ne comprends pas pourquoi ces enzymes ne s'attaquent qu'à des sites de cette forme et non pas à d'autres sites.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Ça dépend des enzymes et certaines enzymes préfèrent certaines séquences à d'autres. Rien de rédhibitoire mais par exemple NotI aime bien avoir une séquence EcorRI à coté du site.

La bio mol c'est sympa quand on la regarde de loin, chiant quand on a le nez dedans.

Cordialement,
piwi

[invite71f23525]

En quoi le fait d'être un site palindromique du style ATAT rend une séquence vulnérable aux enzymes de restriction?

Pour ce qui est de l'explication moléculaire de la reconnaissance de la séquence par l'enzyme, cela se fait par complémentarité structurale et chimique entre les nucléotides de la séquence palindromique et les acides aminés de l'enzyme. C'est un système assimilable à une clef et une serrure : une seule clef ira dans une seule serrure (en oubliant les passe-partout pour l'exemple bien entendu ). La reconnaissance du site par l'enzyme induit un changement conformationnel de l'enzyme qui va approcher les acides aminés du site catalytique à proximité du site de clivage. Ils vont ainsi pouvoir agir sur les nucléotides concernés et cliver la séquence.

Greg