Tampon de lyse extraction ADNg

[invite3eaec7a4]

Bonjour à tous !

Je dois réaliser une extraction d’ADNg à partir de cellules de lignée lymphocytaire. Je possède déjà les culots cellulaires congelés, et j’ai déjà un protocole d’extraction phénol/choloroforme. Mon seul souci, c’est que je n’ai pas de tampon de lyse « maison » pour mes cellules, ni de protocole de lyse. Je sais qu’on peut utiliser un tampon de lyse avec du SDS et de la protéinase K, mais je n’ai aucune idée des proportions, ni du temps d’incubation, ni de la température à utiliser… Quelqu’un pourrait-il m’éclairer ?

J’ai cherché sur ce forum, et Yoyo disait qu’il avait un protocole d’extraction (http://forums.futura-sciences.com/se...archid=4618296). Si tu lis ce message Yoyo, et que ton protocole parle d’un tampon de lyse, pourrais-tu me l’envoyer par MP ? Je t’en serai très reconnaissant !

Merci par avance, bon week end !
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[invite5aa421ae]

bonjour,
Le protocole est assez simple en fait, le tampon de lyse se prépare de cette façon :
100 mM NaCl
10 mM Tris⋅Cl, pH 8
25 mM EDTA, pH 8
0.5% SDS
0.1 mg/ml proteinase K
tu peux stocker le tampon de lyse à température ambiante.
Ensuite le volume à ajouter sur tes cellules est variable suivant le nombre de cellules, pour un nombre de cellules < 3.10^7 ajoute 0,3 ml de tampn de lyse et 1 ml si tu effectue ton extraction sur plus de cellules. Il te suffit ensuite d'incuber tes échantillon 12 à 18h à 50°C sous agitation dans des tubes bien fermés.
Après tu ajoute 1volume équivalent (0,3 ou 1 ml suivant le nombre des cellules) de phenol/chloroform/alcool isoamylique. Centrifuge 10 min à 1700g. Après tu transfert la phase aqueuse dans un nouveau tube et tu ajoutes 1/2 volume d'acétate d'ammonium 7,5M et 2 volume d'éthanol 100%, l'ADN devrait précipité immédiatement. Ensuite centrifuge à 1700g pendant 2 min, jette le surnageant et rince le culot avec de l'éthanol 70%. Enfin laisse secher à l'air les tubes ouvert et après tu resuspends dans du TE :
TRIS 606 mg
EDTA 190 mg
Ajuster le pH à 7.5 avec HCl N/100
Compléter à 10 ml avec eau distillée stérile.

J'espère que ça t'as aidé.
Bon manip
Damien

[invite3eaec7a4]

Bonjour Dam’s,

Merci pour le protocole de lyse !

[invite5aa421ae]

Pas de problème, si tu as des questions hésites pas!

[A voir en vidéo sur Futura]