préparation milieu chapman

[invite654345]

Bonjour,

j'ai posé il y a quelques semaines une question concernant la préparation d'un milieu chapman. Il se trouve que les élèves que je parraine pour un petit concours ont pu obtenir tout ce qu'il faut pour préprarer ce milieu, que ce soit microscope, extrait de levure etc.....
Cependant la dernière fois que j'en ai préparé un remonte à 8 ans d'ici....vous imaginez que je ne m'en souviens pas. J'ai tenté de trouver un protocole sur internet mais je ne tombe que sur des sites donnant la composition en g de chaque élément du milieu.

ce dont j'ai besoin est d'un protocole pratique, me disant mettre la peptone dans x mL d'eau distillée ensuite blablabla...;Quelqu'un peut-il m'aider ? ce serait très aimable de votre part.

Merci d'avance
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[invitea62e5d12]

Bonjour !!

Alors avant de répondre il faudrait savoir combien de boites de Pétri vous voulez couler et quelle est la taille de vos boîtes de Pétri.
Cela permettra de déterminer quel est le volume de milieu à fabriquer

[invite654345]

Bonsoir piranha,

N'étant plus dans cette école, je n'ai pas encore vu la taille des boïtes. Je le saurai demain cependant on peut imaginer (si j'en fait trop tant pis ) qu'elles doivent faire environs 5-6 cm de diamètre. Quant au nombre de boîtes, il est de 15 boîtes.

Si tu peux m'aider je t'en remercie mille fois et te saute virtuellement au cou

[invitea62e5d12]

Alors les 5-6 cm ce sont les petites je crois (pas les standard de 9 cm environ). Je ne sais pas leur volume mais prenons 10 mL par boîtes (ce qui est largement assez), ce qui ferait 150 mL au total mais il serait judicieux d'en prendre plus (je ne sais pas l'expérience des élèves).
On peut partir sur un volume total de 200 mL. Cependant, je ne sais pas ce que vous avez en balance précise car il faudrait avoir 0,005 g de rouge de phénol.
D'après le protocole Bio-Rad (http://bgb.valin-sciences.fr/bgb/ftech/C1R.pdf, il faut mélanger pour 200 mL de volume total :
- 2 g de peptone
- 0,2 g d'extrait de viande de boeuf
- 15 g de chlorure de sodium
- 2 g de mannitol
- 0,005 g de rouge de phénol
- 3 g d'agar
Le pH final doit être de 7,4 (normalement, il y sera mais il serait prudent de vérifier : avec une bandelette pH ou mieux avec un pHmètre étalonné).
On mélange tout ca dans un ballon, on ajoute les 200 mL d'eau STERILE, on mélange pour que les poudres se dissolvent et on fait chauffer au chauffe ballon (je crois que au pire on peut mettre au micro onde).
A ébullition, tout devrait être clair et surtout sans grumeaux. Tout cela permet de dissoudre correctement l'agar. Attention, il est important de "boucher" le ballon par de l'aluminium (si on chauffe au chauffe ballon ou bien du papier film si c'est au micro onde) pour éviter l'évaporation d'eau et donc de fausser les concentrations.

Il faut ensuite stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 min (toujours d'après le protocole Bio-Rad) (ne pas oublier le témoin de stérilisation !!) : il faudrait peut être transféré dans un flacon à cette étape. Après autoclavage, si le milieu s'est resolidifié, le rendre liquide par bain marie (bien fermé le flacon pour que l'eau n'y rentre pas et donc fausser les concentrations). On peut ensuite couler les boîtes de Pétri en remplissant chaque boîte jusqu'à la moitié environ. On laisse enfin refroidir : pour ma part, je laisse un peu la boîte ouverte lors du refroidissement (ca évite la condensation et donc qu'il y ai des gouttes sur le milieu par la suite).
Attention, couler les boites se fait en milieu stérile : sous hotte ou à 15 cm d'une source de chaleur électrique (le gaz étant interdit) !!!
Même le refroidissement se fait à proximité de la source de chaleur
Voilà : je crois que je n'ai rien oublié et si je me rappelle de quelque chose entre temps je renverrai un message
Je ne pense pas me tromper mais si c'est le cas, j'espère que quelqu'un rectifiera !!
Bon travail !

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